Método para determinar la actividad de la trombina en plasma.

Método para determinar el desarrollo de la actividad de trombina en función del tiempo en una muestra de plasma,

según aparece y desaparece de la muestra, que comprende los siguientes pasos:

a) añadir un sustrato señalizador a una mezcla de reacción que contiene una cantidad predeterminada de actividad de trombina, donde dicho sustrato señalizador genera una señal detectable relacionada con el producto de conversión formado después de la reacción con dicha actividad de trombina y medir la señal detectable;

b) proporcionar una curva que muestra la evolución con el tiempo del desarrollo de la señal en dicha mezcla de reacción y determinar la pendiente inicial de la curva, su nivel final y su curvatura;

c) añadir un sustrato señalizador a dicha muestra de plasma donde se produce la generación de trombina, generando dicho sustrato señalizador una señal detectable relacionada con el producto de conversión formado después de la reacción con la trombina, y medir dicha señal detectable para obtener una curva que muestra la intensidad de fluorescencia en función del tiempo;

d1) añadir un compuesto fluorescente a la misma muestra mencionada en el paso c), o a otra muestra del mismo plasma donde se produce la generación de trombina, para obtener una señal detectable a utilizar como medida para la influencia de la turbidez y/o del color del plasma sobre la señal; o

d2) medir la densidad óptica de la misma muestra mencionada en el paso c), o de otra muestra del mismo plasma donde se ha producido la generación de trombina, para obtener una medida en cuanto a la influencia de la turbidez y/o del color del plasma sobre la señal, o

d3) proporcionar una fuente fluorescente y colocar dicha fuente fluorescente de manera que la luz de excitación atraviese la muestra de sangre o plasma hasta la fuente y/o de manera que la luz emitida atraviese dicha muestra para alcanzar el detector, y medir la señal detectada, para obtener una medida en cuanto a la influencia de la turbidez y/o del color provocada por el plasma en la señal;

e) comparar la medida de las señales detectadas en cualquiera de los pasos d1), d2) y d3) con la medida de las señales detectadas en el paso a) para obtener un factor de corrección para la turbidez y el color del plasma en el que se produce la generación de trombina, y

f) utilizar la curvatura del paso b) para corregir no-linealidades en la curva del paso c) usando el factor de corrección del paso e) para corregir la curva del paso c) en cuanto a la turbidez y el color del plasma y utilizar la pendiente inicial del paso b) para calcular la concentración de trombina en función del tiempo a partir de la curva del paso c) con el fin de determinar el desarrollo de la actividad de trombina.

Método para determinar la actividad de la trombina en plasma.

Campo de la invención La presente invención se enmarca en el sector diagnóstico y, en particular, se refiere a un nuevo método para determinar formas biológicamente activas de enzimas proteolíticas, tales como la trombina, en sangre y en otros fluidos, así como a un kit de ensayo para la realización del método.

Antecedentes Muchos laboratorios en el sector bioquímico, químico, médico, diagnóstico y similares están interesados en medir la generación de enzimas en un medio biológico. En general, para ello se utilizan sustratos señalizadores que liberan un cromóforo o fluoróforo que, después de la conversión, proporcionan una señal cromogénica o fluorogénica que se puede seguir en el tiempo y medir.

Un método apropiado para seguir la formación de enzimas con el tiempo en un medio biológico es añadir el sustrato directamente al medio biológico, por ejemplo la adición de un sustrato fluorogénico a un plasma en coagulación donde se forma trombina. Esto tiene la ventaja de que la generación de enzimas se mide en su medio fisiológico.

Las desventajas de este método se derivan de que la actividad de la enzima hacia cualquier sustrato fisiológico, que también puede estar presente en el medio, compite con el sustrato señalizador añadido y de que el sustrato puede consumirse por completo antes de finalizarse la generación de enzimas. Con el fin de minimizar estos efectos, habitualmente se seleccionan aquellos sustratos que no se enlazan estrechamente con la enzima (es decir con KM baja) y que no se convierten demasiado rápidamente (es decir con kcat baja) .

Otro problema es que normalmente la señal medida depende de la turbidez y del color del medio donde se produce la reacción. Por ello, la misma cantidad de enzimas en un medio de diferente origen o de diferentes donantes puede proporcionar una cantidad de señal diferente. Por otro lado, la concentración del cromóforo o fluoróforo puede no ser directamente proporcional a la cantidad de señal. Esto hace más difícil calcular la cantidad de enzima presente durante el tiempo de reacción. Para cuantificar de modo preciso la concentración de enzimas con el tiempo deben tenerse en cuenta todos estos efectos.

La WO 03/093831 describe un método para determinar en tiempo real el desarrollo de la actividad proteolítica, en particular la actividad de trombina, en una muestra de sangre o plasma a medida que aparece y desaparece de la muestra, comprendiendo el método la adición de un sustrato de trombina a la muestra que, por unidad de tiempo, produce una señal detectable en una magnitud que tiene relación con la cantidad de trombina presente. Simultáneamente en una muestra de control de la misma sangre o plasma, donde no se activa la generación de trombina, se mide la actividad de un preparado estándar con una actividad de trombina invariable. Se obtiene la cantidad molar exacta de trombina en cualquier momento por comparación de la actividad medida en sangre en coagulación con una curva de calibración obtenida a partir de una calibración medida simultáneamente. También se describe que si el color del medio no influye en la señal, esta curva de calibración puede determinarse más exactamente para cada color del medio utilizado.

El método para medir la misma cantidad de enzimas calibradas en otro medio de otro color o turbidez resulta en una curva de calibración muy similar excepto en lo que se refiere a los llamados efectos "dependientes del medio".

La presente invención proporciona un método alternativo donde esta curva de calibración se mide sólo una vez en un medio y las medidas en medios similares de diferente color o turbidez no se realizan ya midiendo la curva completa, sino que se pueden sustituir por una medida de "un solo punto".

Sumario de la invención De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para determinar la evolución de la trombina con el tiempo en una muestra de plasma que comprende los siguientes pasos:

a) añadir un sustrato señalizador a una mezcla de reacción que contiene una cantidad predeterminada de actividad de trombina, donde dicho sustrato señalizador genera una señal detectable relacionada con el producto de conversión formado después de la reacción con dicha actividad de trombina y medir la señal detectable;

b) proporcionar una curva que muestra la evolución con el tiempo del desarrollo de la señal en dicha mezcla de reacción y determinar la pendiente inicial de la curva, su nivel final y su curvatura; c) añadir un sustrato señalizador a dicha muestra de plasma donde se produce la generación de trombina,

generando dicho sustrato señalizador una señal detectable relacionada con el producto de conversión formado después de la reacción con la trombina, y medir dicha señal detectable para obtener una curva que muestra la intensidad de fluorescencia en función del tiempo;

d1) añadir un compuesto fluorescente a la misma muestra mencionada en el paso c) , o a otra muestra del mismo plasma donde se produce la generación de trombina, para obtener una señal detectable a utilizar como medida para la influencia de la turbidez y/o del color del plasma sobre la señal; o d2) medir la densidad óptica de la misma muestra mencionada en el paso c) , o de otra muestra del mismo plasma donde se ha producido la generación de trombina, para obtener una medida en cuanto a la influencia de la turbidez y/o del color del plasma sobre la señal, o d3) proporcionar una fuente fluorescente y colocar dicha fuente fluorescente de manera que la luz de excitación atraviese la muestra de sangre o plasma hasta la fuente y/o de manera que la luz emitida atraviese dicha muestra para alcanzar el detector, y medir la señal detectada, para obtener una medida en cuanto a la influencia de la turbidez y/o del color provocada por el plasma en la señal;

e) comparar la medida de las señales detectadas en cualquiera de los pasos d1) , d2) y d3) con la medida de las señales detectadas en el paso a) para obtener un factor de corrección para la turbidez y el color del plasma en el que se produce la generación de trombina, y

f) utilizar la curvatura del paso b) para corregir no-linealidades en la curva del paso c) usando el factor de corrección del paso e) para corregir la curva del paso c) en cuanto a la turbidez y el color del plasma y utilizar la pendiente inicial del paso b) para calcular la concentración de trombina en función del tiempo a partir de la curva del paso c) con el fin de determinar el desarrollo de la actividad de trombina.

Además, la invención proporciona un kit para llevar a cabo el método de la reivindicación 1, que comprende los siguientes componentes:

un reactivo con una concentración conocida de trombina; un reactivo activador para iniciar la generación de trombina, tal como una combinación de fosfolípidos y factor tisular o de fosfolípidos y ácido elágico o de caolín o factor tisular o fosfolípidos solos; un aditivo que facilita el valor de diagnóstico del ensayo, tal como un agente protrombótico o antitrombótico, por ejemplo trombomodulina, heparina, inhibidores directos de trombina o pentasacáridos; un reactivo que contiene un sustrato señalizador o un sustrato señalizador al que se ha añadido un grupo saliente que produce la señal; un programa de software que se puede cargar directamente en la memoria de una computadora capaz de realizar los pasos e) y f) de la reivindicación 1 que toma la señal medida en los pasos a) y c) de la reivindicación 1 y la señal medida en los pasos d1) , d2) ó d3) de la reivindicación 1 para proporcionar los parámetros definidos en el paso b) de la reivindicación 1 y los utiliza para corregir la señal de c) de la reivindicación 1 en cuanto al color y la turbidez y la no-linealidad, calculando después la concentración de trombina con el tiempo utilizando la pendiente inicial del paso b) de la reivindicación 1 y calcula entonces a partir de estas curvas corregidas la actividad enzimática según se determina con el método aquí descrito cuando el programa es ejecutado por un ordenador; una cantidad calibrada de fluoróforo a utilizar dentro o fuera del medio en el que se produce la generación de trombina; una fuente fluorescente que se puede utilizar dentro o fuera del medio en el que se produce la generación de trombina.

La muestra de plasma se selecciona de entre el grupo consistente en sangre y plasma, incluyendo plasma rico en plaquetas, pobre en plaquetas o libre de plaquetas.

Cuando se lleva a cabo el método de la invención con muestras de sangre, habitualmente esta sangre se recoge en tubos que contienen citrato sódico o EDTA o similar, de modo que los iones... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar el desarrollo de la actividad de trombina en función del tiempo en una muestra de plasma, según aparece y desaparece de la muestra, que comprende los siguientes pasos: a) añadir un sustrato señalizador a una mezcla de reacción que contiene una cantidad predeterminada de actividad de trombina, donde dicho sustrato señalizador genera una señal detectable relacionada con el producto de conversión formado después de la reacción con dicha actividad de trombina y medir la señal detectable; b) proporcionar una curva que muestra la evolución con el tiempo del desarrollo de la señal en dicha mezcla de reacción y determinar la pendiente inicial de la curva, su nivel final y su curvatura; c) añadir un sustrato señalizador a dicha muestra de plasma donde se produce la generación de trombina, generando dicho sustrato señalizador una señal detectable relacionada con el producto de conversión formado después de la reacción con la trombina, y medir dicha señal detectable para obtener una curva que muestra la intensidad de fluorescencia en función del tiempo; d1) añadir un compuesto fluorescente a la misma muestra mencionada en el paso c) , o a otra muestra del mismo plasma donde se produce la generación de trombina, para obtener una señal detectable a utilizar como medida para la influencia de la turbidez y/o del color del plasma sobre la señal; o d2) medir la densidad óptica de la misma muestra mencionada en el paso c) , o de otra muestra del mismo plasma donde se ha producido la generación de trombina, para obtener una medida en cuanto a la influencia de la turbidez y/o del color del plasma sobre la señal, o d3) proporcionar una fuente fluorescente y colocar dicha fuente fluorescente de manera que la luz de excitación atraviese la muestra de sangre o plasma hasta la fuente y/o de manera que la luz emitida atraviese dicha muestra para alcanzar el detector, y medir la señal detectada, para obtener una medida en cuanto a la influencia de la turbidez y/o del color provocada por el plasma en la señal; e) comparar la medida de las señales detectadas en cualquiera de los pasos d1) , d2) y d3) con la medida de las señales detectadas en el paso a) para obtener un factor de corrección para la turbidez y el color del plasma en el que se produce la generación de trombina, y

f) utilizar la curvatura del paso b) para corregir no-linealidades en la curva del paso c) usando el factor de corrección del paso e) para corregir la curva del paso c) en cuanto a la turbidez y el color del plasma y utilizar la pendiente inicial del paso b) para calcular la concentración de trombina en función del tiempo a partir de la curva del paso c) con el fin de determinar el desarrollo de la actividad de trombina.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque se añade un activador de proteasa a la citada muestra de plasma antes del paso c) para generar una actividad proteolítica.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicha muestra de plasma se selecciona de entre el grupo consistente en sangre, plasma, incluido plasma rico en plaquetas, plasma pobre en plaquetas o plasma libre de plaquetas.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el sustrato señalizador se selecciona de entre el grupo consistente en compuestos que comprende un grupo saliente, dando dicho grupo saliente un producto de conversión detectable bajo la reacción por la actividad de trombina formada.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque el sustrato señalizador es el sustrato fluorogénico Z-Gly-Gly-Arg-AMC.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el producto de conversión detectable se determina mediante espectroscopía, en particular de fluorescencia, por densidad óptica y por NMR,

o por conductividad eléctrica.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el grupo saliente es un grupo fluorescente, un grupo cromóforo o un grupo que libera iones hidrógeno.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el producto de conversión detectable es p-nitroanilida ó 7-amino-4-metilcumarina.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el activador de proteasa se selecciona de entre el grupo consistente en iones calcio, fosfolípidos, factor tisular, factor tisular soluble, tromboplastina, caolín y ácido elágico.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la muestra de plasma comprende además un agente farmacéutico a ensayar en cuanto a su influencia sobre el sistema proteolítico en estudio.

11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho sistema proteolítico es un sistema hemostáticotrombótico.

12. Método según la reivindicación 10 ó 11, caracterizado porque el agente farmacéutico es un agente antitrombótico, tal como un agente antiplaquetario o anticoagulante.

13. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque el agente antitrombótico se selecciona de entre el grupo consistente en heparina, sulfato de desmatán, un inhibidor directo de trombina, por ejemplo hirudina, argatrobano

o melagatrano, un inhibidor de factor Xa, por ejemplo una proteína anticoagulante de garrapata.

14. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque en el paso d3) la fuente fluorescente es una solución de fluoróforo o un fluoróforo de fuente fluorescente seca unido a un material o una malla o gel o gasa o un material absorbente que se ha hecho fluorescente y al que se añade la sangre o el plasma.

15. Kit adecuado para realizar el método para determinar la evolución de la actividad de trombina según cualquiera

de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende los siguientes componentes: un reactivo con una concentración conocida de trombina; un reactivo activador para iniciar la generación de trombina, tal como una combinación de fosfolípidos y factor tisular o fosfolípidos y ácido elágico o caolín o factor tisular o fosfolípidos solos; un aditivo que facilita el valor de diagnóstico del ensayo, tal como un agente protrombótico o antitrombótico, por ejemplo trombomodulina, heparina, inhibidores directos de trombina o pentasacáridos; un reactivo que contiene un sustrato señalizador o un sustrato señalizador al que se ha añadido el grupo saliente que produce la señal; un programa de software que se puede cargar directamente en la memoria de una computadora capaz de realizar los pasos e) y f) de la reivindicación 1 que toma la señal medida en los pasos a) y c) de la reivindicación 1 y la señal medida en los pasos d1) , d2) ó d3) de la reivindicación 1 para proporcionar los parámetros definidos en el paso b) de la reivindicación 1 y los utiliza para corregir la señal de c) de la reivindicación 1 en cuanto al color y la turbidez y la no-linealidad y calcula después la concentración de trombina en el tiempo utilizando la pendiente inicial del paso b) de la reivindicación 1 y tomando entonces estas curvas corregidas para calcular la actividad enzimática tal como se determina en el método aquí descrito, cuando se ejecuta dicho programa por un ordenador; una cantidad calibrada de fluoróforo a utilizar dentro o fuera del medio en el que se produce la generación de trombina; una fuente fluorescente que se puede utilizar dentro o fuera del medio en el que se produce la generación de trombina.

16. Kit según la reivindicación 15, que comprende reactivos liofilizados.

17. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la pendiente inicial, la curvatura y el nivel final citado en el paso b) se determinan mediante el ajuste del curso temporal de la evolución de la señal de acuerdo con la fórmula:

donde FU (t) es la fluorescencia en función del tiempo de la curva según se menciona en el paso b) , FU (0) es la fluorescencia al inicio de la medida, MAX es el nivel final y K es una contante,

para obtener MAX+FU (0) como nivel final, K como una medida del grado de curvatura y-MAX*K como la pendiente inicial.

18. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la corrección de las no-linealidades mencionadas en el

donde FU-corrected es el valor la de fluorescencia después de corregir la no-linealidad del paso f) , SPM es la medición de un solo punto como medida de la influencia de la turbidez y/o del color causada por el plasma sobre la señal del paso d) ; FU (0) es la fluorescencia en el momento cero de la reacción medida en el paso c) y FU es el valor de fluorescencia medido en el paso c) .

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Señal corregida Señal original

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