Método in vitro de pronóstico de cirrosis hepática.

MÉTODO IN VITRO DE PRONÓSTICO DE CIRROSIS HEPÁTICA DESCRIPCiÓN 5 La presente invención se refiere a un método in vitro de pronóstico y/o diagnóstico de cirrosis para pacientes que padecen hepatitis C crónica, que se caracteriza por la determinación del genotipo en el polimorfismo genético rs368328 del gen HOACS, o cualquiera que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con él (r~, 8) . Adicionalmente puede incluir la determinación de al menos una variable clínica, preferentemente la determinación de la concentración de aspartato aminotransferasa (AST) . 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ESTADO DE LA TECNICA La cirrosis hepática es una patología crónica del hígado que se caracteriza por la muerte progresiva del tejido hepático y su sustitución por tejido fibroso. La acumulación excesiva de matriz extracelular en el parénquima hepático, causada por la sustitución a tejido fibroso, conlleva una alteración estructural y funcional de este órgano. La cirrosis hepática es común en enfermedades crónicas del hígado como son la hepatitis causada por el virus de la hepatitis e (VHC) , la hepatitis causada por el virus de la hepalitis B (VHB) , la enfermedad de hígado graso no alcohólica y la enfermedad hepática alcohólica, la hemocromatosis, la enfermedad de Wilson o el déficit de ol-antitripsina. La infección por VHC es una de las principales causas mundiales de enfermedad hepática crónica, afectando aproximadamente a 170 millones de personas. La actual terapia antiviral consiste en interferon-pegilado más ribavirina; sin embargo, se observa una alta variabilidad en la tasa de respuesta obtenida con este tratamiento. Esta variabilidad se debe tanto a factores virales como factores del paciente. La erradicación del VHC es especialmente dificil en los pacientes infectados por genotipo viral 1, alcanzando una tasa de respuesta cercana al 50% de los pacientes tratados, mientras que los pacientes con genotipos virales 2 y 3 responden un 70% aproximadamente. El fracaso de la terapia tiene importantes repercusiones clínicas debido a que esta enfermedad evoluciona frecuentemente a fibrosis, cirrosis y hepatocarcinoma, complicaciones graves, de costoso manejo y que constituyen la principal causa de transplante hepático. Entre los factores del paciente que influyen en el resultado del tratamiento antiviral se encuentran el sexo, la edad o el indice de masa corporal. Además, se han descrito recientemente que distintos polimorfismos en el gen IL-28B, que codifica para el interferón ) .3, influyen muy significativamente en la respuesta al tratamiento, confirmando la importancia del perfil genético del paciente en la respuesta a estos fármacos. De forma similar, la progresión y pronóstico de la hepatitis C crónica (HCC) es muy variable entre los distintos pacientes, indicando la relevancia de la variabilidad genética interindividual en la etiopatogenia de la HCC. El diagnóstico de la fibrosis hepática se ha basado tradicionalmente en el estudio anatomopatológico de la biopsia. Esta se clasifica siguiendo la escala METAVIA, según la cual existen 5 estadios: fibrosis ligera o ausente (hígado sin fibrosis o fibrosis portal sin septos lobares, FO y Fl) , fibrosis moderada (fibrosis portal con pocos septos, F2) , fibrosis grave (numerosos septos incompletos con distorsión de la arquitectura hepática, pero sin cirrosis, F3) , y cirrosis (F4) . Dependiendo del estadio el pronóstico del paciente es mejor o peor, siendo el estadio de cirrosis (F4) el más grave. Sin embargo, esta técnica es invasiva, limitada por problemas de variabilidad debidos al tamaño de la muestra, interpretación subjetiva y difícil repetición periódica. Por estos motivos, se necesitan tests de diagnóstico no invasivos que puedan reemplazar la biopsia hepática, basados en pruebas indirectas más seguras para el paciente y de menor coste socioeconÓmico. Se han descrito distintos modelos que combinan factores de riesgo sérico, como niveles de alanino aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) , colesterol, % de plaquetas, bilirrubina, etc. Estas escalas (Fibrotest, Forns, APRI, FIB-4, Hepascore, entre otras) permiten la predicción de estadios graves de fibrosis. La determinación de estos marcadores es sencilla y barata, no obstante estos índices solo permiten determinar el estadio de fibrosis hepática en el momento de realizar el diagnóstico, pero no permiten identificar factores pronósticos de riesgo inherentes al paciente como son los polimorfismos genéticos. 2 5 10 15 20 25 30 35 40 En WQ201 0/125220 se ha descrito la combinación de marcadores séricos, concretamente la metaloproteinasa 2 (MMP2) Y AST, con el recuento de plaquetas de una muestra para el diagnóstico del estadio de fibrosis hepática. Según los autores, la cuantificación de estos tres parámetros permite asociar el aumento de la concentración de MMP2 y AST, junto con el descenso del número de plaquetas, a un estadio de fibrosis mayor o igual a F2 o a un estadio de cirrosis. Se han realizado distintos estudios genéticos de uno o varios genes candidatos identificándose distintos polimorfismos asociados a fibrosis; no obstante, no se han realizado suficientes réplicas de estos estudios. Recientemente, se ha descrito una región en el gen IFNGR2, que incluye distintos polimorfismos (rs9976971, rsl0600672, rs2284553 y rS17882748) asociados a estadios de fibrosis hepática 3 y 4 (frente a un grupo comparado de pacientes con estadios de librosis O y 1) . No obstante, este método no analiza la influencia de otras coyariables de riesgo asodadas a fibrosis ni establece un modelo predictiyo y no tiene en cuenta a los pacientes en estadios intermedios (Fquot;, 2) (Nalpas, B. y cols. Gut 201 O, 59:1120·1126) . De forma interesante, Huang y cols. (Hepatology 2007, 46:297·306, US2010/0216154Al y US2011/0129831 Al) describieron una escala de riesgo de cirrosis para pacientes con infección crónica por el VHC basado en un algoritmo procedente de la evaluación de siete polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) en diversos genes candidatos (AZIN 1, TLR4, TRPM5, AQP2, Y otros tres polimorfismos en los cromosomas 1, 3 Y 15) , mostrando la combinación de estos 7 marcadores un AUCROC (AUC, área bajo la curva; ROC, característica operativa del receptor) de 0, 73, que se incrementaba hasta 0, 76 si se incluían otras variables clínicas. Dicho método ha sido replicado posteriormente por otros autores para estimar la precisión predictiya de esos marcadores de progresión de la HCe a fibrosis hepática y cirrosis, tanto desde estadios leves como desde estadios moderados y graves. Sin embargo, en el primer estudio, solo se validaron estos resultados en varones con un AUCROC de 0, 73, mientras que en el segundo estudio no observaron asociación predictiva de la escala basada en los marcadores descritos anteriormente con la eyolución clínica a cirrosis (Marcolongo, M. y cols. Hepatology 2009, 50 (4) :1038-44; Curio, T.M. y cols. Pharmacogenet Genomics 2011, 21 (12) :851·60) . En US2006/0024700 se describe un gran número de secuencias que corresponden a polimorfismos genéticos útiles en el pronóstico de la fibrosis hepática. Estos polimorfismos descritos son usados para asociarlos a un aumento o disminución del riesgo de sufrir fibrosis hepática. En W02008/076954 se describen compuestos heterociciicos inhibidores de la acetilación. Dichos compuestos realizan su función actuando sobre proteínas llamadas histona deacetilasas (HDAC) , entre las que se incluye HDAC5. Por tanto, debido a la notable evolución de las enfermedades crónicas del hígado a cirrosis, sobretodo por infección del VHC, existe una clara necesidad de desarrollar métodos alternativos de diagnóstico y pronóstico no invasivos de cirrosis en pacientes con HCC y otras hepatopatías de distinta etiología con mayor capacidad predictiva. DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN En la presente invención se describe un método sencillo y preciso de pronóstico ylo diagnóstico de cirrosis en pacientes que padecen hepatitis C crónica (HCC) . Dicho método requiere al menos un marcador genético y 45 puede incluir al menos una variable clínica, presentando altos niveles de AUCROC (AUC, área bajo la curva; ROe, característica operativa del receptor) , sensibilidad y especificidad. El método de pronóstico y diagnóstico de cirrosis en pacientes que padecen HCC de la invención es altamente predictivo, no es invasivo y además, es independiente del estatus del paciente. El marcador genético empleado 50 para evaluar el pronóstico solo requiere una única determinación a lo largo de la vida del paciente. La presente invención se refiere a un método in vitro de obtención de datos útiles para el pronóstico y/o diagnóstico de cirrosis, caracterizado por la detección del polimorfismo genético rs368328 del gen HDAC5 o cualquiera de los que se encuentren en desequilibrio... [Seguir leyendo]

Factores clinicos F:S3 F=4 OR (95%CI) P OR (95%CI) P GV1 125 (74%) 18 (90%) No 1 39 (26%) 2 (10%) 0, 35 (0, 08-1, 60) 0, 18 ns ns Edad s40 59 (36%) 8 (40%) (años) gt;40 105 (64%) 12 (60%) 0, 84 (0, 33-2, 18) 0, 72 ns ns Carga s600000 40 (24, 3%9 7 (35%) viral basal gt;600000 124 13 (65%) 0, 60 (0, 22-1, 60) 0, 3 (75, 7%) ns ns (IUfml) ALT s40 31 (18, 7%) 4 (17, 4%) basal 134 (U/L) gt;40 (81, 3%) 19 (82, 6%) 4, 39 (0, 57-34, 10) 0, 15 ns ns AST s40 72 (43, 6%) 8 (40%) basal 10, 75 (U/L) gt;40 93 (56, 4%) 12 (60%) 6, 96 (1 , 56-31 , 00) 0, 01 (1, 36-85, 26) 0, 025 GGT s30 57 (34, 9%) 8 (40%) basal 106 (U/L) gt;30 (65, 1%) 12 (60%) 4, 84 (1, 08-21, 60) 0, 039 ns ns HOAC5 NG-G/G 80 (55, 9%) 4 (28, 6%) 1 1 rs368328 3, 12 3, 38 AlA 63 (44, 1%) 10 (71, 4%) (0, 95-11, 1) 0, 047 (1, 01-11, 6) 0, 05 Tabl.

4. Área bajo la curva de los distintos modelos de regresión logística. Variables AUC ICa195% Sensibilidad (%) Especificidad (%) AST 0, 685 0, 565-, 0805 93 44 HDAC5 0, 637 0, 490-0, 784 71 56 HDAC5 + AST 0, 770 0, 643-0, 896 71 77 14

1. Un método in vitro de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o pronóstico de cirrosis hepática caracterizado porque comprende la determinación del genotipo de al menos un polimoñismo genético del gen 5 HDAC5 seleccionado de la lista que comprende: rs368328, rs454192, rs189050, rs228746 y rs228749, en una muestra biológica aislada de un sujeto que padece hepatitis C crónica. 1.

2. Método según la reivindicación 1, en el que además se determina la concentración de aspartato aminotransferasa (AST) en una muestra biológica aislada de un sujeto que padece hepatitis C crónica.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 donde el polimorfismo es rs368328.

4. Un método in vitro para el diagnóstico y/o pronóstiCO de la cirrosis hepática de un sujeto que padece hepatitis C crónica que comprende las siguientes etapas: 15 a. la determinación del genotipo en al menos un polimorfismo genético del gen HDAC5 seleccionado de la lista que comprende: rs368328, rs454192, rs189050, rs228746 y rs228749, en una muestra biológica aislada de un sujeto que padece hepatitis C crónica, b. la asociación del genotipo A/A en el pOlimorfismo genético rs368328, del genotipo G/G en el polimorfismo genético rs454192, del genotipo G/G en el polimorfismo genético rs189050, del genotipo 20 G/G en el polimorfismo genético rS228746, o del genotipo C/C en el polimorfismo genético rs228749, del gen HDAC5 determinado en la etapa (a) a un diagnóstico y/o pronóstiCO de cirrosis hepátic.

5. Método según la reivindicación 4, que además comprende las siguientes etapas: c. la determinación de la concentración de AST en una muestra biológica aislada del mismo sujeto de la 25 etapa (a) , d. la asociación de valores de concentración de AST superiores a 40 U/L a un diagnóstico y/o pronóstico de cirrosis hepática.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, donde en el paso (b) el genotipo que se asocia a un 30 diagnóstico y/o pronóstico de cirrosis hepática es el genotipo AJA del polimorfismo genético rs368328. 3.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 5 Y 6, donde la determinación de la concentración de AST se realiza en la misma muestra biológica Que la determinación del genotipo del polimorfismo del gen HDAC5.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 5 Y 6, donde la determinación de la concentración de AST se realiza en una muestra biológica distinta Que la determinación del genotipo del polimorfismo del gen HDAC5. 4.

9. Método según la reivindicación 7, donde la muestra biológica es sangre. 45 50 5.

10. Método según la reivindicación 8, donde la muestra biológica en la que se determina la concentración de AST es sangre y la muestra biológica en la que se determina el genotipo del polimorfismo del gen HDAC5 se selecciona de la lista Que comprende un tejido o un fluido biológico.

11. Método según la reivindicación 10, donde el fluido biológico se selecciona de entre sangre, plasma, suero y linfa.

12. Método según la reivindicación 11, donde el fluido biológico es sangre.

13. Método según la reivindicación 10, donde el tejido es mucosa oral.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la determinación del genotipo se realiza mediante sondas de hibridación marcadas con f1uoróforos.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde el sujeto es un humano.

16. Uso de al menos un pOlimorfismo genético del gen HDAC5 seleccionado de la lista que comprende: rs368328, rs454192, rs189050, rs228746 y rs228749 como marcador pronóstiCO de cirrosis hepática de un sujeto 60 Que padece hepatitiS C crónica.

17. Uso según la reivindicación 16, donde el polimorfismo genético del gen HDAC5 es rs368328. 15 5 10 18-Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, donde el polimorfismo se usa en combinación con la determinación de la concentración de AST.

19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde el sujeto es un humano.

20. Uso de un kit que comprende sondas que permiten determinar el genotipo en al menos un polimorfismo genético del gen HOAC5 seleccionado de la lista que comprende: rs368328. rs454192, (s189050, (s228746 y rs228749 para la obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o pronóstico de la cirrosis hepática en un sujeto que padece hepatitis C crónica.

21. Uso según la reivindicación 20, donde el kit comprende sondas que permiten determinar el polimorfismo genético rs368328 del gen HOAC5 para la obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o pronóstico de la cirrosis hepática en un sujeto que padece hepatitis C crónica. 1.

22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21, donde el sujeto es un humano.

23. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, donde el kit además comprende los elementos necesarios para determinar la concentración de AST. 16 100 en w 80 1-:z: 60 w u 40 oC ( CL. 20 FIG.1 quot;#. 0+--'---quot;C al 1, 0 0, 8 :2 0, 6 .c ., lt;: Jl 0, 4 0, 2 FO-3 FIG.2 -HDAC5 + AST (AUC~O. 77) --HDAC5 (AUC~O.64) ---AST (AUC~O.68) Línea de referencia , ; / , ) , 1 v quot; '/ , ~ , ~ , ~ , ~ ~ , ~ • , , ¡ F4 ~ O, O...L. f---~---, ---~--~--~-0, 0 0, 2 0, 4 0, 6 0, 8 1, 0 1 -Especificidad 17 DG .NA