Método de detección de moléculas bioactivas en una muestra líquida.

Un método de detección de la presencia de moléculas bioactivas en una muestra líquida,

que comprende:

poner en contacto una solución de un microorganismo seleccionado entre el grupo compuesto por un alga y unacianobacteria unicelulares con la muestra líquida de modo que se obtenga una formulación que tenga unaconcentración de microorganismos de 200.000-1 x 107 células/ml de muestra líquida,

incubar la formulación durante 10 a 120 minutos a un pH de 7 a 12 y una temperatura entre 18 y 35ºC con luzambiente seguido de una incubación con luz verde o en oscuridad, y

medir la fluorescencia emitida por la formulación;

en el que una fluorescencia emitida por la muestra menor que la de la muestra control es una indicación de que lamuestra contiene una molécula bioactiva.

Método de detección de moléculas bioactivas en una muestra líquida

Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos de detección de moléculas bioactivas en una muestra líquida.

Antecedentes de la invención A escala mundial, la contaminación patógena del agua potable representa el riesgo más significativo para los seres humanos. Sin embargo, los riesgos significativos para la salud humana también pueden ser el resultado de la exposición a contaminantes químicos tóxicos no patógenos que están siempre presentes en las aguas de las que deriva el agua potable. La contaminación química de las corrientes y fuentes de agua se ha convertido en un problema importante ya que muchos de los compuestos químicos que ponen en riesgo la salud de los ecosistemas acuáticos tienen la posibilidad de poner en peligro la salud humana.

En la publicación internacional N.º WO 2004/046717 A1, se describieron biosensores y bioensayos basados en la fotosíntesis para detectar moléculas tóxicas en líquidos y métodos y kits para su uso.

Es sabido que la inhibición de la fotosíntesis por diferentes contaminantes (inhibidores) puede cambiar el estado fisiológicos de las plantas (Papageorgiou, 1975; Govindjee, 1995; Krause G.H. y Weis E. 1991) . Por tanto, los parámetros bioquímicos vegetales ligados a la fotosíntesis, como la formación de ATP, la fijación de CO2 y la evolución del O2, se han utilizado en el pasado como indicadores de toxicidad inducida por contaminantes (Samson y Popovic, 1990; Pascal y Popovic, 1993; Laberge y col., 1999; Rouillon y col., 2000) . La complejidad de estos métodos y el tiempo necesario para obtener resultados con ellos los hacen, en cambio, poco convenientes como herramientas en toxicología ambiental.

El uso de algas fotosintéticas en lugar de tilacoides permite la detección de moléculas bioactivas que actúan sobre procesos metabólicos distintos a la fotosíntesis que pueden medirse indirectamente a través de la actividad fotosintética (organofosforados, antibióticos, aminas, etc.) .

Los métodos de la técnica previa usando algas para detectar contaminantes requerían hasta 7 días de incubación.

En la presente invención se hace referencia a varios documentos.

Sumario de la invención La presente invención utiliza de forma ventajosa microorganismos completos como algas unicelulares y cianobacterias. En realizaciones específicas, permiten la detección de contaminantes antes de un máximo de 60 minutos de incubación con o sin adyuvantes.

Los adyuvantes pueden modificar la carga de las moléculas bioactivas, la permeabilidad de la membrana, el estado fisiológico del alga y/o determinados procesos metabólicos diferentes que afectan directa o indirectamente a la 45 fotosíntesis. Por ejemplo, el pH modifica la carga de las moléculas bioactivas, la temperatura afecta a la permeabilidad celular, la exposición a la luz o a la oscuridad durante la incubación afecta al estado fisiológico del alga, la adición de moléculas orgánicas (como atrazina o tetraciclina) y/o moléculas inorgánicas (como iones metálicos) en los medios de reacción afecta al metabolismo del alga y el uso de la menor concentración de alga posible optimiza la sensibilidad del ensayo. Los adyuvantes se comportan de forma diferente dependiendo de la especie de alga utilizada. En concreto, la composición de las membranas y las paredes celulares varía con el tipo de microorganismo utilizado y esta variación confiere a estos microorganismos una especificidad y/o sensibilidad mayores a determinadas moléculas bioactivas.

Muchas moléculas bioactivas como los COP (contaminantes orgánicos persistentes) , insecticidas y antibióticos, no 55 afectan directamente al proceso de fotosíntesis o lo hacen directamente pero con mayor dificultad debido a que no pueden atravesar fácilmente la pared y la membrana celular. En las algas y en otros microorganismos, las moléculas bioactivas interfieren con otros procesos metabólicos celulares como el crecimiento y el ciclo celular, movilidad, respiración, captación de nutrientes y síntesis de ácidos nucleicos y proteínas. El solicitante determinó que esta interferencia con otros procesos metabólicos celulares también tiene un efecto inhibidor, aunque indirecto, sobre la actividad fotosintética. Seleccionando la especie de alga más sensible, modificando la permeabilidad de la pared celular (para metales bioactivos, por ejemplo) y la membrana celular (modificando el pH, la temperatura o los iones, usando compuestos químicos conocidos como permeantes de la membrana celular ) , podrá enfatizarse y/o acelerarse el estado fisiológico del alga por las condiciones de luz y oscuridad, el efecto (directo o indirecto) de moléculas bioactivas sobre la actividad fotosintética.

Más específicamente, según la presente invención, se proporciona un método de detección de la presencia de moléculas bioactivas en una muestra líquida, que comprende poner en contacto una solución de un microorganismo seleccionado a partir del grupo compuesto por un alga unicelular y una cianobacteria con la muestra líquida de modo que se obtenga una formulación que tenga una concentración de microorganismos de 200.000-1 x 107 células/ml de muestra líquida; incubar la formulación durante 10 a 120 minutos a pH de 7 a 12 y una temperatura entre 18 y 35ºC

con luz ambiente seguido de incubación con luz verde o en oscuridad y medir la fluorescencia emitida por la formulación, de modo que una fluorescencia emitida por la muestra sea menor que la de la muestra control es una indicación de que la muestra contiene una molécula bioactiva.

En una realización específica, la incubación con luz verde o en oscuridad tiene una duración de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 minutos. En una realización específica, la incubación con luz verde o en oscuridad tiene una duración de aproximadamente 15 minutos. En otra realización específica, el pH de incubación está entre aproximadamente 4 y 12. En otra realización específica, el pH de incubación está entre aproximadamente 11 y 12. En otra realización específica, la solución del microorganismo se activó con luz ambiente antes de la fase de incubación. En otra realización específica, la formulación además comprende un aditivo. En otra realización específica, el aditivo es cadmio. En otra realización específica, el aditivo es H2O2. En otra realización específica, el aditivo es cobre. En otra realización específico, los aditivos son cadmio y cobre.

En otra realización específica, el microorganismo es una Chlorophyceae. En otra realización específica, el microorganismo es una Chlorophyceae de agua dulce. En otra realización específica, el microorganismo es Chlorella vulgaris. En otra realización específica, la temperatura de incubación es de aproximadamente 35ºC. En otra realización específica, la solución del microorganismo se activó con luz ambiente durante al menos 90 minutos antes de la fase de incubación. En otra realización específica, la concentración celular de microorganismo está entre aproximadamente 2, 5 x 106 y 5 x 106 células/ml de solución acuosa. En otra realización específica, la concentración celular de microorganismo es de aproximadamente 2, 5 x 106 células/ml de solución acuosa. En otra realización específica, la molécula bioactiva se selecciona entre el grupo compuesto por atrazina, diurón, glifosato, clorpirifós, cobre, plomo, cadmio, mercurio, cianuros, tetraciclina, cinc, níquel y nitrógeno amoniacal.

En otra realización específica, el microorganismo es Ankistrodesmus falcatus. En otra realización específica, el microorganismo es Monoraphidium arcuatum. En otra realización específica, el microorganismo es Scenedesmus quadricauda. En otra realización específica, el microorganismo es Desmosdesmus subspicatus. En otra realización específica, el microorganismo es Scenedesmus subpicatus En otra realización específica, el microorganismo es Scenedesmus obliquus. En otra realización específica, el microorganismo es Pseudokirchneriella subspicata. En otra realización específica, el microorganismo es Chlamydomonas reinhardtii.

En otra realización específica, el microorganismo es una Chlorophyceae marina. En otra realización específica, el microorganismo es Dunaliella tertiolecta. En otra realización específica, la concentración celular de Dunaliella tertiolecta está entre aproximadamente 200.000 y 350.000 células/ml de solución acuosa. En otra realización específica, la solución de Dunaliella tertiolecta se activó con luz ambiente durante al menos 45 minutos antes de la fase de incubación. En otra realización específica, la molécula bioactiva se selecciona entre el grupo... [Seguir leyendo]

1. Un método de detección de la presencia de moléculas bioactivas en una muestra líquida, que comprende:

poner en contacto una solución de un microorganismo seleccionado entre el grupo compuesto por un alga y una cianobacteria unicelulares con la muestra líquida de modo que se obtenga una formulación que tenga una concentración de microorganismos de 200.000-1 x 107 células/ml de muestra líquida,

incubar la formulación durante 10 a 120 minutos a un pH de 7 a 12 y una temperatura entre 18 y 35ºC con luz 10 ambiente seguido de una incubación con luz verde o en oscuridad, y

medir la fluorescencia emitida por la formulación;

en el que una fluorescencia emitida por la muestra menor que la de la muestra control es una indicación de que la 15 muestra contiene una molécula bioactiva.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la incubación con luz verde o en oscuridad tiene una duración de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 minutos, incluso más preferiblemente de aproximadamente 15 minutos.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que el pH de incubación está entre aproximadamente 4 y 12, más preferiblemente entre aproximadamente 11 y 12.

4. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la solución de microorganismo se activó con luz ambiente antes de la fase de incubación. 25

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la formulación además comprende un aditivo, preferiblemente el aditivo es cadmio, H2O2, cobre o cadmio y cobre.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el microorganismo es una Chlorophyceae. 30

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el microorganismo es una Chlorophyceae de agua dulce, preferiblemente Chlorella vulgaris.

8. El método de la reivindicación 7, en el que la temperatura de incubación es de aproximadamente 35ºC. 35

9. El método de la reivindicación 7, en el que la solución de microorganismo se activó con luz ambiente durante al menos 90 minutos antes de la fase de incubación.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la concentración celular de microorganismo

está entre aproximadamente 2, 5 x 106 y 5 x 106 células/ml de solución acuosa, preferiblemente de aproximadamente 2, 5 x 106 células/ml de solución acuosa.

11. El método de una cualquier de las reivindicaciones 7 a 10 en el que la molécula bioactiva se selecciona entre el

grupo compuesto por atrazina, diurón, glifosato, clorpirifós, cobre, plomo, cadmio, mercurio, cianuros, tetraciclina, 45 cinc, níquel y nitrógeno amoniacal.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el microorganismo es Ankistrodesmus falcatus, Monoraphidium arcuatum, Scenedesmus quadricauda, Desmosdesmus subspicatus, Scenedesmus subpicatus, Scenedesmus obliquus, Pseudokirchneriella subspicata, Chlamydomonas reinhardtii, marine 50 Chlorophyceae, Phaeodactylum tricornutum, Nitzschia closterium, Lasallia pustulata o Zostera caprocorni.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el microorganismo es Dunaliella tertiolecta.

14. El método de la reivindicación 13, en el que la concentración celular de Dunaliella tertiolecta está entre

aproximadamente 200.000 y 350.000 células/ml de solución acuosa y, preferiblemente, la solución de Dunaliella tertiolecta se activó con luz ambiente durante al menos 45 minutos antes de la fase de incubación.

15. El método de la reivindicación 13 o 14 en el que la molécula bioactiva se selecciona entre el grupo compuesto por atrazina, diurón, glifosato, malatión, clorpirifós, progesterona y dicrotofós. 60

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el microorganismo es una cianobacteria, preferiblemente Anabaena sp. o Nostoc commune y en el que la solución de cianobacteria se activó preferiblemente con luz ambiente durante al menos 60 minutos antes de la fase de incubación.