PROCEDIMIENTO PARA DETECTAR LA SENSIBILIDAD DE LOS MICROORGANISMOS A QUITOSANO.
Procedimiento para detectar la sensibilidad de los microorganismos a quitosano.
Método de detección de la sensibilidad de los microorganismos, preferiblemente hongos, al compuesto quitosano y método para modificar dicha sensibilidad. Estos métodos pueden aplicarse a la obtención o selección de hongos más resistentes o más sensibles a este compuesto. El método de detección de la sensibilidad comprende: analizar el perfil de ácidos grasos, poliinsaturados, saturados y monoinsaturados, de la membrana plasmática del microorganismo, y asociar el perfil de ácidos grasos obtenido con un fenotipo sensible a quitosano, el cual se caracteriza por presentar unos niveles mayores de ácidos grasos poliinsaturados que de ácidos grasos saturados y monoinsaturados. El método de modificación de la sensibilidad a quitosano comprende modificar la fluidez de la membrana plasmática del microorganismo, preferiblemente mediante la administración de quitosano en combinación con al menos un compuesto que modifique la fluidez de la membrana plasmática, o mediante la inducción de mutaciones en genes que codifican para enzimas desaturasas de ácidos grasos
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200930199.
Solicitante: UNIVERSIDAD DE ALICANTE.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: ALICANTE.
Inventor/es: LOPEZ JIMENEZ,JOSE ANGEL, LOPEZ LLORCA,LUIS VICENTE, SALINAS CALVETE,JESUS, PALMA GUERRERO,JAVIER, JANSSON,HANS-BORJE.
Fecha de Solicitud: 22 de Mayo de 2009.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 26 de Mayo de 2011.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/18 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › Investigación o análisis de la actividad antimicrobiana de un material.
- C12Q1/20 C12Q 1/00 […] › utilizando medios polivalentes.
Clasificación PCT:
- A01N43/16 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01N CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES O DE PARTES DE ELLOS (conservación de alimentos o productos alimenticios A23 ); BIOCIDAS, p. ej. EN TANTO QUE SEAN DESINFECTANTES, PESTICIDAS O HERBICIDAS (preparaciones de uso médico, dental o para el aseo que eliminan o previenen el crecimiento o la proliferación de organismos no deseados A61K ); PRODUCTOS QUE ATRAEN O REPELEN A LOS ANIMALES; REGULADORES DEL CRECIMIENTO DE LOS VEGETALES. › A01N 43/00 Biocidas, productos que atraen o repelen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen compuestos heterocíclicos (que contienen anhídridos cíclicos, imidas cíclicas A01N 37/00; que contienen compuestos de fórmula , que no tienen más que un heterociclo en los que m≥1 y n≥0 y es una pirrolidina, una piperidina, una morfolina, una tiomorfolina, una piperazina o una polimetilenoimina, no sustituida o sustituida por un alcoilo, que tiene al menos cuatro grupos CH 2 A01N 33/00 - A01N 41/12; que contienen ácidos ciclopropanocarbhoxílicos o sus derivados, p. ej. ésteres con heterociclos, A01N 53/00). › con oxígeno como heteroátomo del ciclo.
- A01N63/02
- C12Q1/20 C12Q 1/00 […] › utilizando medios polivalentes.
Fragmento de la descripción:
Procedimiento para detectar la sensibilidad de los microorganismos a quitosano.
La presente invención se refiere a un método de detección de la sensibilidad de los hongos al compuesto quitosano y a un método para modificar dicha sensibilidad. Estos métodos pueden aplicarse a la obtención o selección de hongos más resistentes o más sensibles a este compuesto.
Estado de la técnica anterior
El quitosano es un polímero formado por subunidades de β-1-4-glucosamina, un derivado parcialmente desacetilado de la quitina, que posee efectos inhibidores del crecimiento de hongos y bacterias, pero no de células de mamífero. Estas propiedades lo convierten en un compuesto antibiótico idóneo para su aplicación en medicina y en la industria alimentaria (Rabea E.I., et al., 2003, BioMacromolecules 4, 1458-1465), aunque también es de utilidad para otros fines, como por ejemplo, para la inducción de la esporulación en hongos empleados como agentes del control biológico (WO2008102044 A1); o para controlar las plagas y enfermedades que afectan a plantas de horticultura y agricultura (US005374627 A), entre otros.
El quitosano ejerce su actividad antibiótica a través del daño en la membrana plasmática de bacterias y hongos, como Saccharomyces cerevisiae y hongos filamentosos (Zakrzewska, A., et al., 2005, Eukaryotic Cell 4:4, 703-715). Se ha sugerido que esto ocurre mediante la interacción de los grupos amino con carga positiva del quitosano con las cargas negativas de los fosfolípidos de la membrana plasmática (El Ghaouth, A. and Azul, J., 1992, Mycological research 96, 769-773).
Las membranas plasmáticas están compuestas principalmente por lípidos, asociados a proteínas y carbohidratos (en forma de glicolípidos y glicoproteínas), y su fluidez depende del tipo de ácidos grasos presentes, en concreto de la longitud de la cadena hidrocarbonada y del grado de insaturación, aunque también del nivel de esteroles y de la naturaleza de otros lípidos constituyentes. En el caso de los hongos, los ácidos grasos son los mismos para todos los hongos, sin embargo, los niveles de cada uno de ellos varía entre las distintas especies.
Los perfiles de los ácidos grasos celulares totales (Haack, S.K., et al., 1994, Applied and Environmental Microbiology 60, 2483-2493) se han utilizado normalmente para estimar biomasa microbiana y para obtener información de la diversidad y del estado nutricional de los microorganismos. El potencial del análisis de los ácidos grasos como herramienta taxonómica para hongos también ha recibido especial atención en estudios recientes (Kaur, A., et al., 2005, Current Science 89, 1103-1112). Estos estudios han demostrado que la comparación de los ácidos grasos es una medida robusta de similitud a nivel inferior a familia.
La sensibilidad de los hongos a quitosano es variable entre los distintos grupos de hongos, siendo más sensibles los hongos fitopatógenos, que los hongos nematófagos y entomopatógenos empleados como agentes de control biológico (Palma-Guerrero, J., et al., 2008, Journal of Applied Microbiology 104, 541-553).
Diversos trabajos se basan en el estudio del efecto de determinadas mutaciones sobre la sensibilidad a quitosano en la levadura S. cerevisiae. Así, la eliminación de genes que codifican proteínas implicadas en el mantenimiento de la integridad de la membrana plasmática así como diferentes formas de estrés de la membrana, conducen a un aumento en la sensibilidad a quitosano. Otros grupos de hongos sensibles a quitosano son aquellos que portan deleciones en genes implicados en la vía de señalización HOG (high-osmolarity glycerol). Se ha demostrado que las células expuestas a condiciones hipertónicas son ligeramente más resistentes a quitosano, mientras que las condiciones hipotónicas sensibilizan a las células frente al mismo. Deleciones en genes implicados en la síntesis y procesamiento de RNA, en la organización del citoesqueleto de actina, en la N-glicosilación de proteínas, en la síntesis de ergosterol, en la endocitosis o en la formación de la pared celular también se han asociado con un aumento en la sensibilidad al compuesto. Por otro lado, el empleo de drogas como la tunicamicina, miconazol y estaurosporina en combinación con el quitosano, provoca asimismo sensibilidad a este compuesto. También la exposición de las células a 37ºC, temperatura a la que se cree que aumenta la fluidez de la membrana, induce sensibilidad a quitosano (Zakrzewska, A., et al., 2007, Eukaryotic Cell 6:4, 600-608).
Pero no sólo se ha tratado de modificar la sensibilidad a quitosano en levaduras. En bacterias Gram negativas la deleción de genes que intervienen en la ruta de síntesis del ácido teicoico y lipoteicoico, conlleva un aumento en la resistencia a quitosano, debido a la disminución de las cargas negativas en la pared celular (Raafat, D., et al., 2008, Applied and Environmental Microbiology 74:12, 3764-3773).
No obstante, estos estudios de alteración de la sensibilidad a quitosano están encaminados hacia la elucidación de los efectos del quitosano sobre los microorganismos y su mecanismo de acción, así como a la identificación de los genes y procesos celulares implicados en dicha sensibilidad, sin llegar a proponer un método de detección de la misma.
Debido a la variabilidad en la vulnerabilidad de los microorganismos a quitosano y a las múltiples aplicaciones de este compuesto antibiótico, es necesario disponer de un método que permita determinar la sensibilidad o resistencia de los mismos.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona un método de detección de la sensibilidad de los hongos al compuesto quitosano y un método para modificar dicha sensibilidad.
Analizando los componentes que determinan la fluidez de la membrana plasmática, en concreto los ácidos grasos, de hongos resistentes y sensibles a quitosano, se ha observado un patrón diferencial entre ambos grupos, lo que ha permitido establecer una asociación entre el perfil de ácidos grasos obtenidos y la resistencia o sensibilidad del microorganismo. De manera que, dependiendo de las cantidades de determinados ácidos grasos, poliinsaturados, saturados y monoinsaturados, se puede clasificar a los hongos en sensibles o resistentes a quitosano.
Ya que la susceptibilidad a este compuesto está relacionada con la composición de ácidos grasos de la membrana del hongo, modificando dicha composición o, en general, la fluidez de la membrana plasmática, es posible alterar dicha susceptibilidad.
Por lo tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un método de detección de la sensibilidad a quitosano en microorganismos, de ahora en adelante "primer método de la invención", que comprende:
En la presente descripción se entiende por "microorganismo" cualquier ser vivo perteneciente al reino Bacteria o al reino Fungi, es decir, bacterias y hongos, entendiéndose como "hongo" tanto hongos filamentosos (mohos) como hongos levaduriformes (levaduras).
El quitosano interacciona con la membrana del hongo para ejercer sus efectos inhibitorios sobre el crecimiento, al igual que ocurre en el caso de otros microorganismos, como es el caso de las bacterias. Por ello, mediante el análisis de los componentes que determinan la fluidez de la membrana de bacterias, y más concretamente, de los ácidos grasos que las componen, sería posible establecer una relación entre la sensibilidad al quitosano y un determinado perfil de ácidos grasos, como en el caso de los hongos. En base a esto, aunque los ejemplos de la presente invención pongan de manifiesto la efectividad del método de detección de sensibilidad a quitosano y del método de modificación de dicha sensibilidad en hongos, también podría ser posible aplicarlos a las bacterias.
Se entiende por "perfil de ácidos grasos" la composición y cantidad de cada tipo de ácidos grasos que presenta la membrana plasmática del microorganismo. Los ácidos grasos son moléculas formadas por una larga cadena de átomos de carbono y de hidrógeno, de estructura lineal, con un número par de átomos de carbono, y en un extremo un grupo carboxilo. Su...
Reivindicaciones:
1. Método de detección de la sensibilidad a quitosano en microorganismos que comprende:
2. Método de detección de la sensibilidad a quitosano según la reivindicación 1, donde los ácidos grasos son poliinsaturados, saturados y monoinsaturados.
3. Método de detección de la sensibilidad a quitosano según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde el microorganismo es un hongo.
4. Método de detección de la sensibilidad a quitosano según la reivindicación 3, donde los ácidos grasos poliinsaturados son: ácido linoleico o ácido linolénico.
5. Método de detección de la sensibilidad a quitosano según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, donde los ácidos grasos saturados son: ácido palmítico o ácido esteárico.
6. Método de detección de la sensibilidad a quitosano según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde el ácido graso monoinsaturado es el ácido oleico.
7. Método de detección de la sensibilidad a quitosano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el fenotipo sensible se asocia con unos niveles mayores de ácidos grasos poliinsaturados que de ácidos grasos saturados y monoinsaturados.
8. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano en microorganismos que comprende modificar la fluidez de la membrana plasmática del microorganismo.
9. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano según la reivindicación 8, donde la modificación de la fluidez de la membrana se realiza mediante la administración de quitosano en combinación con al menos un compuesto que modifique la fluidez de la membrana plasmática.
10. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano según la reivindicación 9, donde el compuesto que modifica la fluidez de la membrana es: DMSO o Alcohol Bencílico.
11. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano según la reivindicación 8 donde la modificación de la fluidez de la membrana se realiza mediante la inducción de mutaciones en genes que codifican para enzimas desaturasas de ácidos grasos.
12. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde el microorganismo es un hongo.
13. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano en microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, donde la enzima desaturasa es: oleoil-Δ12 desaturasa o linoleoil-n3 desaturasa.
14. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano en microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 donde la mutación es una deleción.
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