Método de detección de cianobacterias y bacterias patógenas presentes en agua o en amebas de vida libre.

Método de detección de cianobacterias y bacterias patógenas presentes en agua o en amebas de vida libre.

La presente invención se refiere a un método de detección de cianobacterias productoras de microcistina y de al menos una bacteria patógena en una muestra de agua o en amebas de vida libre presentes en el agua caracterizado por la detección y/o cuantificación de los genes mcyD, mip, hsp65 o R16S. Además también se refiere al método en el que también se puede detectar el gen ompU. La presente invención también se refiere a un kit que contiene al menos los cebadores útiles para la detección de dichos genes y su uso para el análisis de la calidad del agua.

Método de detección de cianobacterias y bacterias patógenas presentes en agua o en amebas de vida libre.

La presente invención se refiere a un método de detección simultánea de cianobacterias productoras de microcistina y de bacterias patógenas en una muestra de agua o en amebas de vida libre presentes en el agua caracterizado por la detección y/o cuantificación del gen mey y al menos uno de los genes míp, hsp65 o 16S. Además también se refiere a un kit que comprende los cebadores útiles para la detección de dichos genes. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la medicina y de la salud pública.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La creciente eutrofización y deterioro de los acuíferos origina un incremento de la biomasa presente tanto en cuerpos de agua como en biofilms, conteniendo una gran cantidad de microorganismos potencialmente tóxicos para la salud humana. La prevención sanitaria implica su detección temprana y destrucción y es una tarea realizada de forma habitual en los laboratorios de salud pública. Muchas veces, los organismos patógenos pueden quedar enmascarados y protegidos de los sistemas tradicionales de detección y desinfección por alojarse en el interior de amebas de vida libre, lo que entraña unos riesgos importantes para la salud.

Se ha demostrado que las amebas de vida libre (AVL) pueden albergar distintos géneros de bacterias entre las que también se han detectado cianobacterias. Las amebas son protozoos ubicuos que habitan en ambientes húmedos, frecuentemente en agua con temperaturas en torno a los 25 grados. Algunas AVL representan un riesgo sanitario por sí mismas, como es el caso de Aeanthamoeba spp. o Hartma n ella spp., y también pueden actuar como vectores de bacterias patógenas y cianobacterias potencialmente tóxicas, jugando un importante papel en la resistencia de estos microorganismos frente a condiciones adversas y permitiéndoles sobrevivir en su interior, lo que representa un riesgo para la salud.

Entre las cianobacterias asociadas a AVL se han detectado cianobacterias productoras de microcistina, como es el caso de Míeroeystís spp responsable de la toxicidad. (Yuichiro N et al. The Japanese Society of Limnology 2004. (5) :71-76; y Liu X et al. , Shi Miao, Liao Yonghong, Gao Yin, Zhang Zhongkai, Wen Donghui, Wu Weizhong Grazing Upon Cyanobacteria: Food Selection, Ingestion and Digestion Progress Microbial ecology. 2006. (51) , 315-325) . Las microcistinas son heptapéptidos cíclicos de síntesis no ribosomal que están codificadas por el operón mey. El gen meyO codifica una policétido sintasa modular que presenta una alta homología en todas las cepas tóxicas de diferentes géneros de cianobacterias. Su expresión es indispensable para la síntesis de microcistina y está implicado en la incorporación del aminoácido Adda (3-amino-9-metoxi-1 O-fenil-2, 6, 8-trimetil-deca-4, 6-ácido dienóico) .

Otro de los patógenos mas problemáticos y que suele causar víctimas mortales es la bacteria Legíonella pneumophíla. Es muy conocido el fenómeno de su persistencia tras los procesos de desinfección en torres de refrigeración, probablemente debido a que se enmascara en el interior de AVL. La presencia de Legíonella spp. en el interior de las amebas se ha descrito no solamente en los circuitos de refrigeración, sino también en biofilms formados en diferentes habitats naturales y en sistemas acuáticos antropogénicos. Junto con Legíonella pneumophíla también existen numerosas referencias de la presencia del Myeobaeteríum spp. (en este caso suelen coexistir varias especies de Myeobaeteríum en una misma muestra) ) y Pseudomonas spp. En países tropicales, cabe destacar la presencia de brotes de Víbrío eholerae, detectados tanto en estado libre como en el interior de amebas como Aeanthamoeba spp.

o Naeglería spp. entre otras. La presencia de estas bacterias patógenas en el interior de las AVL hace difícil su detección y supone un importante riesgo para la salud si no son detectadas correctamente y eliminadas del agua.

En la actualidad los métodos de detección utilizados más frecuentemente se basan en el cultivo previo de estos microorganismos que, en ocasiones es extremadamente lento ( Roch N and Maurin M. J Antimicrob Chemother 2005. (55) :866-871) . También existen protocolos de amplificación mediante RT-PCR a tiempo real de estos patógenos de forma individual, aunque son protocolos que en la mayoría de los caso se aplican en centros de investigación, ya que se requiere instrumental con cierta sofisticación que no existe en prácticamente ningún laboratorio de análisis rutinario de aguas o de salud pública.

El análisis de calidad de aguas, en especial la de uso humano, requiere de herramientas rápidas y de sencillo manejo que permitan la detección de patógenos libres en el agua o bien alojados en el interior de organismos acuáticos, como es el caso de las A VL. En consecuencia, existe la necesidad de una herramienta que rápida, precisa y sensible para la detección de cianobacterias potencialmente tóxicas y de bacterias patógenas, con el fin de mejorar la calidad del agua.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere a un método de detección simultánea de cianobacterias productoras de microcistina y al menos una de las bacterias patógenas Míeroeystís spp., Legíonella spp., Myeobaeteríum spp., o Pseudomonas spp. tanto en agua como en organismos acuáticos, preferentemente en amebas de vida libre. Este método se basa en el aislamiento de ácidos nucleicos de una muestra de agua o de organismos acuáticos y en la realización de una PCR multiplex acoplada a una PCR anidada. El método de la invención permite detectar simultáneamente el gen mey y al menos un gen de entre los genes míp, hsp65 o R16S. Además, el método de la invención también puede aislar y/o detectar en una muestra de agua o de los organismos acuáticos otra bacteria patógena, Víbrío spp., mediante la detección y/o cuantificación del gen ompU.

El método de la invención permite alcanzar una gran sensibilidad y a la vez es capaz de minimizar los falsos positivos, así como evitar posibles inhibidores de la polimerasa que conducirían a la lectura de falsos negativos, como es el caso de inhibidores que suelen estar presentes en las muestras antropogénicas (Radstrom et al Mol Biotechnol 2004. 26:133-146) . El método de la invención se ha valorado en 107 muestras de campo demostrando su utilidad, tanto en muestras de agua procedente de embalses, piscinas, fuentes ornamentales, aguas emergentes de depuradoras y también de cultivos de amebas de vida libre aislados de muestras de agua de embalses, piscinas, aguas emergentes de depuradoras y fuentes ornamentales.

El método de la invención es más rápido que los métodos que dependen del crecimiento previo de los patógenos, además, tiene una gran sensibilidad. El método de la invención permite conocer con un único ensayo las asociaciones entre estos microorganismos más frecuentes y detectar posibles riesgos para la salud. Por otra parte, este método es fácil de ejecutar con un instrumental económico y disponible en muchos laboratorios.

Por lo aquí descrito, un primer aspecto de la invención se refiere a un método de detección y/o cuantificación de al menos una cianobacteria productora de microcistina y de al menos una bacteria patógena caracterizado por que comprende los siguientes pasos:

a. aislamiento de ácidos nucleicos presentes en una muestra de agua o de organismos acuáticos; y

b. detección y/o cuantificación del gen meyO y al menos uno de los genes que se seleccionan de la lista que comprende: míp, hsp65

o 165 mediante PCR multiplex seguida de PCR anidada. En adelante nos referiremos a éste como el método primero de la invención.

Una cianobacteria (también llamada "alga verdeazulada") es una bacteria que realiza fotosíntesis oxigénica. Las cianobacterias a las que se refiere la invención son aquellas productoras de microcistina, en adelante las "cianobacterias de la invención". El término "microcistina" se refiere a una toxina que consiste en un heptapéptido cíclico de síntesis no ribosomal producido por algunas especies de cianobacterias. Entre las cianobacterias productoras de microcistinas se encuentran las cianobacterias del género Míeroeystís, Anabaena, Anabaenopsís, Hapalosíphon y Planktothríx.

El término "bacteria patógena" se refiere a aquella bacteria que no realiza fotosíntesis oxigénica y que puede provocar una enfermedad en un sujeto, preferentemente humano. Las bacterias patógenas a las que se refiere la invención son las bacterias del género Legíonella spp., Myeobaeteríum spp., Pseudomonas spp. o Víbrío spp. En adelante nos referiremos... [Seguir leyendo]

1. Método de detección y/o cuantificación de al menos una cianobacteria productora de microcistina y de al menos una bacteria patógena caracterizado por que comprende los siguientes pasos:

a. aislamiento de ácidos nucleicos presentes en una muestra de agua o de organismos acuáticos; y

b. detección y/o cuantificación del gen meyO y al menos uno de los genes que se seleccionan de la lista que comprende: míp, hsp65

o 165 mediante PCR multiplex seguida de PCR anidada.

2. Método según la reivindicación 1 donde además se detecta y/o se cuantifica el gen ompU de forma simultánea o no simultánea mediante PCR.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde el organismo acuático es una ameba de vida libre.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la cianobacteria es del género Míeroeystís spp.

5. Método según la reivindicación 4 donde la cianobacteria es Míeroeystís aerugínosa.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la bacteria patógena se selecciona de entre Legíonella pneumophíla, Myeobaeteríum spp. o Pseudomonas spp.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde el ácido nucleico es ácido desoxirribonucleico.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde la PCR

multiplex se realiza utilizando los cebadores SEO ID NO: 1 y SEO ID NO: 2 y al menos una pareja de cebadores que se seleccionan de la lista que comprende: SEO ID NO: 3 y SEO ID NO: 4, SEO ID NO: 5 y SEO ID NO: 6, o SEO ID NO: 7 y SEO ID NO: 8.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la PCR anidada se realiza utilizando los cebadores SEO ID NO: 11 y SEO ID NO: 12 y al menos una pareja de cebadores que se seleccionan de la lista que comprende: SEO ID NO: 13 y SEO ID NO: 14, SEO ID NO: 15 y SEO ID NO: 16, o SEO ID NO: 17 y SEO ID NO: 18.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9 donde además se utiliza la pareja de cebadores SEO ID NO: 9 y SEO ID NO: 10, en la PCR multiplex.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde además se utiliza la pareja de cebadores SEO ID NO: 19 y SEO ID NO: 20 en la PCR anidada.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que además comprende la detección y/o cuantificación de al menos una cianobacteria productora de microcistina y de al menos una bacteria patógena mediante el cultivo de la cianobacteria o de la bacteria patógena.

13. Kit que comprende una pareja de cebadores que amplifican el gen meyO y al menos una pareja de cebadores que amplifican un gen que se selecciona de la lista que comprende míp, hsp65 o 165.

14. Kit según la reivindicación 13 donde los cebadores que amplifican el gen meyO son SEO ID NO: 1 y SEO ID NO: 2 y/o los cebadores SEO ID NO: 11 ySEO ID NO: 12.

15. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, que comprende al menos una pareja de cebadores que se seleccionan de la lista que comprende: SEO ID NO: 3 y SEO ID NO: 4, SEO ID NO: 5 y SEO ID NO: 6, o SEO ID NO: 7 y SEO ID NO: 8, SEO ID NO: 13 y SEO ID NO: 14, SEO ID NO: 15 y SEO ID NO: 16, o SEO ID NO: 17 y SEO ID NO: 18.

16. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 que además comprende los cebadores que amplifican el gen ompU.

17. Kit según la reivindicación 16 donde los cebadores que amplifican el gen ompU son SEO ID NO: 9 y SEO ID NO: 10 y/o SEO ID NO: 19 y SEO ID NO: 20.

18. Uso del kit según las reivindicaciones 13 a 17 para la detección de una cianobacteria productora de microcistina y de al menos una bacteria patógenas en una muestra de agua o en organismos acuáticos, donde la bacteria patógena es Legíonella pneumophíla, Myeobaeteríum spp., o Pseudomonas spp o Víbrío eholerae.

19. Uso de kit según la reivindicación 18 donde la cianobacteria es del género

Míeroeystís spp.

20. Uso del kit según la reivindicación 19 donde la cianobacteria es Míeroeystís aerugínosa.

21. Uso del kit según las reivindicaciones 18 a 20 donde el organismo acuático es una ameba de vida libre

22. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 donde la muestra de agua es para consumo humano.

23. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 donde el agua

es agua de recreo, de riego u ornamental.

FIG.1

r16S 476 bp hsp65 297 bp -----+ mcyD 194 bp -----+ mip 112 bp -----+

M

FIG.2

A) 1 2 3 M B) 1 2 3 4 5 6 M

~

338 R16S

----\11

mcyD

mcyD----+ 282 ---+-194 mip ----+ 168 bp -ti>

FIG.3

M

R16S-Pseudomonas Hsp65-Mycobacterium McyD-Microcystis Mip-Legionella LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Universidad de zaragoza <120> Método de detección de cianobacterias y

bacterias patógenas presentes en agua o en amebas de vida 1i bre <130> Es1510.97

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador sentido para PCR multiplex del gen mcyD

<400> 1 gagcattaag ggctaaatcg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador antisentido para PCR multiplex del gen mcyD

<400> 2 cttggttgct tcatcaactc 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador sentido para la PCR multiplex del gen mip

<400> 3 gcattggtgc cgatttgg 18

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador antisentido para la PCR multiplex del gen mip

<400> 4 gytttgcatc aaatctttct gaa <210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220> <400> 10 cggaagtttg gcttgaagta 9 <220>

<223> Cebador sentido para la PCR multiplex del gen hsp65

<400> 5 cccgtacgag aagatcgg 18

<210> <211> <212> <213> 6 18 DNA Artificial 5equence

<220> <223> Cebador antisentido para la PCR multiplex del gen hsp65

<400> 6 gactcctcga cggtgatg 18

<210> <211> <212> <213> 7 20 DNA Artificial 5equence

<220> <223> Cebador sentido para la PCR spp. multiplex del gen 165 de Pseudomonas

<400> 7 ggtctgagag gatgatcagt 20

<210> <211> <212> <213> 8 20 DNA Artificial 5equence

<220> <223> Cebador antisentido para la PCR Pseudomonas spp. multiplex del gen 165 de

<400> 8 tctgtaccga ccattgtagc 20

<210> <211> <212> <213> 9 20 DNA Artificial 5equence

<220> <223> Cebador sentido para la PCR multiplex del gen ompu

<400> 9 gctgacggaa tcaaccaaag 20

<210> <211> <212> <213> 10 21 DNA Artificial 5equence

<220> <223> Cebador antisentido para la PCR multiplex del gen ompu

<210> <211> <212> <213> 11 25 DNA Artificial Sequence

<220> <223> Cebador sentido para la PCR anidada del gen mcyD

<400> 11 tcatagcccc atatccttta gcggc 25

<210> <211> <212> <213> 12 25 DNA Artificial Sequence

<220> <223> Cebador antisentido para la PCR anidada del gen mcyD

<400> 12 ctgctgtatc tttaattggc tcggc 25

<210> <211> <212> <213> 13 25 DNA Artificial Sequence

<220> <223> Cebador sentido para la PCR anidada del gen mip

<400> 13 gaagcaatgg ctaaaggcat gcaag 25

<210> <211> <212> <213> 14 29 DNA Artificial Sequence

<220> <223> Cebador antisentido para la PCR anidada del gen mip

<400> 14 gctttgccat caaatctttc tgaaacttg 29

<210> <211> <212> <213> 15 21 DNA Artificial Sequence

<220> <223> Cebador sentido para la PCR anidada del gen hsp65

<400> 15 gagctggtca aggaagtcgc c 21

<210> <211> <212> <213> 16 21 DNA Artificial Sequence

<223> Cebador antisentido para la PCR anidada del gen hsp65

<400> 16 gttgccgacc ttgtccatcg c 21

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador sentido para la PCR anidada del gen 16s de Pseudomonas spp.

<400> 17 gacgttaccg acagaataag caccg 25

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador antisentido para la PCR anidada del gen 16s Pseudomonas spp.

<400> 18 aaccacatgc tccaccgctt gtg 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador sentido para la PCR anidada del gen ompu <400> 19 caggttcaac cgtttacagc gcg 23

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador antisentido para la PCR anidada del gen ompu <400> 20 gcgaagtaca ggttttccat gcgg 24

<210> 21

<211> 198

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Secuencia amplificada del gen mcyD de Microcystis aeruginosa PCC 7806

<400> 21 tcatagcccc atatccttta gcggctaatc tctccaaaac attgcgatct actgctgcac 60

ctatttcact ccaaggaccc caatttatga ccgttccggg taaatgatgc gtctgacgat 120

aatagataaa agcgtcttca aaggcattag ctgccgcagc attagcttgt cctgccgagc 180 caattaaaga tacagcag 198

<210> 22

<211> 113

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Secuencia amplificada del gen mip de Legionella pneumophilaphiladelphia-1

<400> 22 gaagcaatgg ctaaaggcat gcaagacgct atgagtggcg ctcaattggc tttaaccgaa 60

cagcaaatga aagacgttct taacaagttt cagaaagatt tgatggcaaa acg 113

<210> 23

<211> 297

<212> DNA

<213> Artifi ci al Sequence <220>

<223> Secuencia amplificada del gen hsp65 de Mycobacterium tuberculosis H37Rv

<400> 23 gagctggtca aggaagtcgc caagaagacc gacgacgtgg ccggtgacgg cacgacgacg 60 gccacggtgc tggcccaggc gctggtgcgc gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc 120 aacccgctcg gcctgaagcg cggcatcgag aaggccgtcg agaaggtcac ggagaccctg 180

ctgaagtcgg ccaaggaggt cgagaccaag gaccagatcg cggccaccgc cgcgatttcc 240 gcgggcgacc agtcgatcgg cgacctgatc gccgaggcga tggacaaggt cggcaac 297

<210> 24

<211> 476

<212> DNA

<213> Artifi ci al Sequence <220>

<223> Secuencia amplificada del gen 16s de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

<400> 24 gacgttaccg acagaataag caccggctaa ctctgtgcca gcagccgcgg taatacagag 60 ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcgc gtaggtggtt cgttaagttg 120 gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcattcaa aactgtcgag ctagagtatg 180 gtagagggtg gtggaatttc ctgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatagg aaggaacacc 240 agtggcgaag gcgaccacct ggactgatac tgacactgag gtgcgaaagc gtggggagca 300 aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtcaactagc cgttgggagc 360

cttgagctct tagtggcgca gctaacgcat taagttgacc gcctggggag tacggccgca 420 aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtt 476

<210> 25

<211> 652

<212> DNA

<213> Artifi ci al Sequence <220>

<223> Secuencia amplificada del gen ompu de vibrio cholerae MJ-1236

<400> 25 caggttcaac cgtttacagc gcgaaaggta cttctctaga agttggtggc cgtgctgaag

ctcgcctatc tctgaaagat ggtaaggcac aagacaactc tcgcgtacgt ctaaacttct 120

tgggtaaagc agaaatcaat gacagcctat acggtgttgg tttctacgaa ggcgagttta 180

ctactaatga tcaaggtaaa aacgcgtcta acaacagcct agacaaccgt tatacctacg 240

ctggtatcgg tggcacttac ggtgaagtga cttacggtaa aaacgatggc gcattgggcg 300

taatcactga cttcaccgat atcatgtctt accacggtaa cacagccgca gaaaaaattg 360

ctgtagcaga ccgtgttgac aacatgctgg cttacaaagg ccaatttggt gacctaggcg 420

taaaagcaag ctaccgtttt gctgaccgta acgctgttga cgcaatgggt aatgttgtaa 480

ctgaaacaaa cgctgccaag tactctgaca acggtgaaga tggttactct ctgtctgcta 540

tctacacttt cggtgacact ggctttaacg taggtgctgg ctacgcagat caagacgatc 600

aaaacgaata catgctagcc gcttcttacc gcatggaaaa cctgtacttc gc 652

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador sentido para la PCR multiplex del gen 16s para Legionellapneumophila <400> 26 gagggttgat aggttaagag c 21

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador antisentido para la PCR multiplex del gen 16s de Legionella pneumophila <400> 27 gtcaacttat cgcgtttgct

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador sentido para la PCR anidada del gen 16s para Legionellapneumophila <400> 28

ctggacgtta cccacagaag aagc 24

<210> <211> <212> <213> 29 23 DNA Artificial Sequence

<220> <223> Cebador antisentido para la PCR anidada del Legionella pneumophila gen 16s para

<400> 29 gtttacagcg tggactacca ggg 23

<210> <211> <212> <213> 30 431 DNA Artificial Sequence

<220> <223> Secuencia amplificada del philadelphia-l gen 16s de Legionella pneumophila

<400> 30 gagggttgat aggttaagag ctgattaact ggacgttacc cacagaagaa gcaccggcta 60

actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtgcgagc gttaatcgga attactgggc 120

gtaaagggtg cgtaggtggt tgattaagtt atctgtgaaa ttcctgggct taacctggga 180

cggtcagata atactggttg actcgagtat gggagagggt agtggaattt ccggtgtagc 240

ggtgaaatgc gtagagatcg gaaggaacac cagtggcgaa ggcggctacc tggcctaata 300

ctgacactga ggcacgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 360

ctgtaaacga tgtcaactag ctgttggtta tatgaaaata attagtggcg cagcaaacgc 420

gataagttga c 431