Método de cribado de preparaciones de parásitos para la eficacia en la prevención y control de enfermedades.

Un método de cribado in vitro de una preparación de parásitos helmínticos que altera el nivel de una actividadde las células T reguladoras humanas,

comprendiendo dicho método los pasos de:

(a) obtener una preparación de parásitos helmínticos;

(b) poner en contacto dicha preparación de parásitos helmínticos con un sistema humano in vitro quecontiene células T reguladoras; y

(c) determinar el nivel de un marcador interno para la actividad de las células T reguladoras en dicha dianadespués de dicho contacto, en donde dicho marcador interno es el factor de transcripción FOXP3 (Scurfina);en donde un cambio en dicho nivel de dicho marcador interno después de dicho contacto es indicativo de que dicha

Método de cribado de preparaciones de parásitos para la eficacia en la prevención y control de enfermedades

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta descripción se refiere a métodos que utilizan preparaciones de parásitos helmínticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los parásitos son entidades vivas que residen sobre o en el interior de otras criaturas durante alguna parte de sus ciclos vitales, extrayendo nutrientes del hospedador. Los parásitos que habitan en los intestinos tienen una interacción compleja con el sistema inmunitario mucosal. Los mismos tienen que establecer una relación tranquila con las defensas mucosales del hospedador para sobrevivir.

La disregulación del sistema inmunitario que conduce a una respuesta anormal Th1 o Th2 puede ser la causa de varias enfermedades humanas. Algunas enfermedades debidas a respuestas dominantes Th1 incluyen IBD, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerosis múltiple, y diabetes mellitus dependiente de insulina. Enfermedades relacionadas con Th2 incluyen enfermedades alérgicas y cáncer.

Recientemente, se ha demostrado que la descripción a parásitos reduce la gravedad de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) (Sewell et al., 2003, International Immunology, 15:59-69) . La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal para esclerosis múltiple (MS) caracterizado por desmielinación inflamatoria crónica del sistema nervioso central (CNS) . Sewell informó que, en ratones con inmunización con ovas de Schistosoma mansoni, la gravedad de la EAE se reduce tal como se mide por registros clínicos disminuidos e infiltrados celulares del CNS. Existe un nivel reducido de IFN-gamma y niveles aumentados de IL-4, factor beta del crecimiento transformante e IL-10 en la periferia, y la frecuencia de células T específicas del neuroantígeno productor de IL-4 en el cerebro aumenta.

La enfermedad de Crohn es resultado de la inflamación mucosal disregulada del tipo T adyuvantes (Th) 1. La enfermedad de Crohn es rara en los países tropicales, pero prevaleciente en los países desarrollados con climas templados, en los cuales su incidencia se ha elevado desde 1940. En contraste, la descripción a parásitos helmínticos es común en los países tropicales pero es rara en los países desarrollados. Elliott et al. (2003 Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 284: G385-G391) demostró que los helmintos pueden atenuar la inflamación excesiva de tipo Th1. Para comprobar esta hipótesis, se expusieron ratones a huevos del helminto Schistosoma mansoni y se enfrentaron luego por vía rectal con ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) para inducir colitis. La descripción a los huevos de esquistosoma atenuaba la colitis por TNBS y protegía los ratones contra la inflamación letal. La descripción a huevos de esquistosoma disminuía IFN-gamma y aumentaba la producción de IL-4 por las células de los nódulos linfáticos del bazo y mesentéricos estimulados con anti-CD3 de los ratones tratados con TNBS. La descripción a huevos de esquistosoma reducía el IFN-gamma en el colon pero aumentaba la expresión de mRNA de IL-10 en los ratones tratados con TNBS. Se requería el transductor de señales y activador de la transcripción 6 intacto para atenuación de la colitis. Los autores demostraron que la descripción a helmintos puede reducir la inflamación del colon en los murinos.

De Jong et al. (2002, J. Immunol., 168: 1704-1709) demostró que un extracto de proteínas derivado del helminto Schistosoma mansoni inducía el desarrollo de DC2s que promueven el desarrollo de células Th2 por la vía de la expresión incrementada del ligando OX40. Análogamente, la toxina procedente de la bacteria extracelular Vibrio cholerae inducía también el desarrollo de DC2s, aunque por la vía de un mecanismo independiente del ligando OX40, todavía desconocido. En contraste, la toxina procedente de la bacteria intracelular Bordetella pertussis inducía el desarrollo de DC1s con producción aumentada de IL-12, que promueve un desarrollo de células Th1. El poli (I:C) (dsRNA, mimético para el virus) inducía el desarrollo de DC1 inductor de Th1 extremadamente potente sin una producción incrementada de IL-12.

La Solicitud de Patente U.S. 2003/0103938 A1 da a conocer una composición farmacéutica constituida por IL-4 y SDF-1a, o IL-2 y SDF-1a para prevención o tratamiento de una enfermedad relacionada con las células Th1 o Th2 en un humano o un animal por modulación de la ratio Th1/Th2.

Doetze et al. (2000, International Immunology, 12:623-630) investigaron la hiposensibilidad proliferativa de las células T al antígeno Ov (OvAg) por las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos con infecciones helmínticas crónicas, es decir, oncocerciasis generalizada (GEO) , comparada con PBMC de individuos supuestamente inmunes (PI) . En este estudio, se investigaron mecanismos mediadores de esta hiposensibilidad celular en GEO: la respuesta proliferativa baja en PBMC de individuos GEO estaba asociada con una falta de producción de IL-4 y producción significativamente reducida de IL-5 comparada con las de los individuos PI, lo que argumentaba contra un desplazamiento general hacia una respuesta T (h) 2 como causa de la hiposensibilidad. En contraste, IL-10 y el factor de crecimiento transformante (TGF) -beta, dos citoquinas asociadas con una respuesta T (h) 3, parecían mediar la hiposensibilidad: los PBMC de individuos con GEO producían significativamente más IL10, y la hiposensibilidad proliferativa de las células T en este grupo podía invertirse por la adición de anticuerpos anti-IL-10 y anti-TGF-beta. Los autores demostraron que la hiposensibilidad era específica para OvAg y no se observaba después de estimulación con antígenos de nematodos afines, lo que argumentaba a favor de una regulación decreciente específica de Ov mediada por las células T. Las células T específicas de Ov podían clonarse a partir de PBMC de GEO que tienen un perfil de citoquinas singular (ausencia de IL-2 pero producción elevada de IL-10 y/o TGF-beta) , análogo a los subconjuntos de células T que se sabe suprimen la inflamación en curso (T (h) 3 y T (r) 1) , indicando que este tipo de célula que no se ha encontrado hasta ahora en enfermedades infecciosas puede estar implicado en el mantenimiento de la hiposensibilidad específica de Ov.

Las células Th3 son un subconjunto de células T reguladoras y se generaron e identificaron originalmente en ratones tolerantes por vía oral a MPP y que suprimían la inducción de la encefalomielitis experimental autoinmune (EAE) por un mecanismo dependiente de TGF-b (Chen et al., 1994, Science, 265:1237-1240) . Estudios recientes sugieren que las células T reguladoras pueden ser inducidas contra antígenos bacterianos, virales y parásitos in vivo y podrían prevenir la enfermedad autoinmune, la inmunología inducida por infección o prolongar la persistencia de patógenos por supresión de respuestas Th1 protectoras (véase, por ejemplo, McGuirk and Mills, 2002, Trends in lmmunology, 23:450-455; Tung et al., 2001, Immunological Reviews, 182:135-148; y Maloy and Powrie, 2001, Nature Immunology, 2:816-822) .

Las células T reguladoras se describen generalmente como linfocitos que suprimen las respuestas inmunes, es decir, tanto las mediadas por anticuerpos como las mediadas por células (v.g., para revisiones, véase McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulator y T cells provoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol 2002; 23 (9) :450-5; Field, A. C., L. Caccavelli, M. F. Bloch, and B. Bellon. 2003. Regulator y CD8+ T cells control neonatal tolerance to a Th2-mediated autoimmunity. Journal of Immunology. 170:2508-2515; von Herrath MG, Harrison LC. Antigen-induced regulator y T cells in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 2003 Mar; 3 (3) :223-32; Francois Bach J. Regulator y T cells under scrutiny. Nat Rev Immunol. 2003 Mar; 3 (3) :189-98; Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ. CD4 (+) regulator y T cells in autoimmunity and allergy. Curr Opin Immunol. 2002 Dec; 14 (6) :771-8; McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulator y T cells provoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol. 2002 Sep; 23 (9) :450-5; Tung KS, Agersborg SS, Alard P, Garza KM, Lou YH. Regulator y T-cell, endogenous antigen and neonatal environment in the prevention and induction of autoimmune disease. lmmunol Rev. 2001 Aug; 182:135-48; Read S, Powrie F. CD4 (+) regulator y T cells. Curr Opin lmrnuno1. 2001 Dec; 13 (6) :644-9; Yssel H, Lecart S, Pene J. Regulator y T cells and allergic asthma. Microbes Infect. 2001 Sep; 3 (11) :899-904) . Estas células T reguladoras (células Tr) expresan una proteína transmembranal (llamada CD25) que es la cadena alfa del receptor para... [Seguir leyendo]

1. Un método de cribado in vitro de una preparación de parásitos helmínticos que altera el nivel de una actividad de las células T reguladoras humanas, comprendiendo dicho método los pasos de:

(a) obtener una preparación de parásitos helmínticos;

(b) poner en contacto dicha preparación de parásitos helmínticos con un sistema humano in vitro que contiene células T reguladoras; y

(c) determinar el nivel de un marcador interno para la actividad de las células T reguladoras en dicha diana después de dicho contacto, en donde dicho marcador interno es el factor de transcripción FOXP3 (Scurfina) ;

en donde un cambio en dicho nivel de dicho marcador interno después de dicho contacto es indicativo de que dicha 10 preparación de parásitos helmínticos altera una actividad de las células T reguladoras.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho nivel de dicho factor de transcripción se mide en su nivel de proteínas o de mRNA.

3. El método de la reivindicación 1, en donde dicha actividad mediada por las células T reguladoras se encuentra en las células mononucleares de la lámina propia de dicho sistema.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dicha actividad mediada por las células T reguladoras se encuentra en los nódulos linfáticos mesentéricos de dicho sistema.

5. Un método para monitorizar la eficacia del tratamiento de una preparación de parásitos helmínticos para una enfermedad autoinmune o alérgica en un modelo animal no humano que comprende:

(i) administrar una composición que comprende una preparación de parásitos helmínticos o una fracción de la 20 misma a dicho modelo animal no humano; y

(ii) determinar el nivel de un marcador interno para la actividad de las células T reguladoras en dicho modelo animal no humano después de dicha administración, en donde dicho marcador interno es el factor de transcripción FOXP3 (Scurfina) ;

en donde un aumento en dicho nivel de dicho marcador interno después de dicha administración es indicativo de la 25 eficacia de tratamiento de dicha preparación de parásitos helmínticos.

6. El método de la reivindicación 5, en donde dicho nivel de dicho factor de transcripción se mide en su nivel de proteína o de mRNA.

7. El método de la reivindicación 5, en donde dicho nivel de dicho marcador se encuentra en las células mononucleares de la lámina propia de dicho modelo.

8. El método de la reivindicación 5, en donde dicho nivel de dicho marcador se encuentra en los nódulos linfáticos mesentéricos de dicho modelo.

Figura 2 Figura 3

FIGURA 4. IL-4 puede curar los ratones de una infección crónica de H. polygyrus. Los ratones recibieron tres inyecciones de un complejo de IL4 comenzando 12 días antes del sacrificio. Los datos son valoresmedios ± SE de determinaciones múltiples.

Figura 4

H. POLYGYRUS BLOQUEA LA SÍNTESIS DE IL12 DE LA MUCOSA

LA COLONIZACIÓN CON H. POLYGYRUS PROMUEVE LA PRODUCCIÓN DE PGE2 DE LA MUCOSA

LAS CÉLULAS T MLN DE LOS RATONES PORTADORES DE H. POLYGYRUS PENETRAN EN LA MUCOSA INTESTINAL CUANDO SE TRANSFIEREN A RECEPTORES WT