MÉTODO DE AISLAMIENTO DE INGENOL.

Método de aislamiento de Ingenol. La presente invención detalla un nuevo método para aislar Ingenol (C20H28O5),

en un único paso, a partir de mezclas de ésteres diterpenoides y ésteres de ingenol. El Ingenol aislado mediante este método puede ser usado como precursor para la síntesis de derivados de ingenol biológicamente activos, como el Ingenol 3-Angelato y el Ingenol 3-Tigliato.

DESCRIPCIÓN

MÉTODO DE AISLAMIENTO DE INGENOL

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se engloba dentro del campo de la biología, la farmacia y la medicina. Más específicamente la presente invención se refiere a un método de aislamiento de ingenol a partir de mezclas de ésteres diterpenoides y ésteres de ingenol, más en particular cuando dichas mezclas provienen de plantas, específicamente, a partir de semillas del género Euphorbia y, más en concreto, a partir de semillas de la especie E. lathyris.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los ingenoles son compuestos que, aunque pueden obtenerse por síntesis química, están también presentes fundamentalmente en plantas de la familia Euphorbiaceae, especialmente en 15 aquellas variedades con actividad purgante [Evans FJ y Kinghorn ADJ. Linn. Soc. Bot. (London) 1977;74:23-35; Evans FJ y Taylor SE. In Progress in the Chemistr y of Organic Natural Products; Herz W, Grisebach H, Kirby GW, Eds.; Springer: New York, 1983; 44:1-99]. En concreto el ingenol (C20H28O5) (número de registro CAS 30220-46-3) (Fórmula I) se ha aislado de las semillas de plantas de la especie Euphorbia lathyris L., comúnmente conocida como tártago. El

aceite de semilla de tártago se comercializa en diferentes países del mundo y es una importante materia prima para la industria química ya que se usa en la composición de numerosos productos como pinturas, barnices, cosméticos, lubricantes, plásticos, biodiesel, etc.

Me Ingenol (Formula I)

Me: CH3 todo a lo largo de la presente memoria

Durante los últimos años se ha generado un gran interés en el compuesto ingenol y sus derivados, debido a sus importantes actividades biológicas. Ciertos ingenoles y en especial los derivados esterificados en la posición 3´, ya sean naturales u obtenidos por semisíntesis, presentan una potente actividad anticancerígena y antiviral [Ogbourne SM et al. Cancer Res 2004;64:2833-9;

Benhadji KA et al. Br J Cancer. 2008;99 (11) :1808-15; Kedei N et al. Cancer Res. 2004;64 (9) :3243-55; Warrilow D et al., AIDS Res Hum Retroviruses. 2006;22 (9) :854-64; Fujiwara M et al., Antimicrob Agents Chemother. 1996;40 (1) :271-3]. Por semisíntesis se entiende el aislamiento de ingenol a partir de plantas que lo contengan y la sustitución en su estructura molecular, por reacciones químicas apropiadas en cada caso, de grupos que den origen a los diferentes derivados de interés. Dichos derivados esterificados en posición 3´ que presentan actividad biológica y que pueden ser utilizados en clínica son preferentemente el Ingenol 3-Tigliato (Fórmula II) y el Ingenol 3-Angelato (Fórmula III) .

Ingenol-3-Tigliato (Fórmula II)

Ingenol 3-Angelato (Fórmula III)

El ingenol está presente en forma de ésteres, en mezclas con ésteres diterpenoides, en plantas y en extractos vegetales. Sin embargo, las semillas de tártago son la única fuente comercial para el aislamiento de ingenol, a partir del cual, es posible obtener, mediante diferentes métodos químicos, los derivados de ingenol biológicamente activos utilizados en clínica. Dichas semillas presentan una compleja matriz que contiene, además de grasas (40-47%) y proteínas (15%) [Duke,

J. D. Handbook of Energy Crops http://www.hort.purdue.edu/newcrop) ], una serie de esteres diterpenoides conocidos como Factores Euphorbia L1-L9, que comprenden una pequeña cantidad, pero relativamente constante, de monoésteres de ingenol (L4, L5, and L6) [Adolf W y Hecker EZ. Krebsforsch. 1975, 84, 325-344], siendo la fracción que contiene el ingenol minoritaria en comparación con la fracción que contiene los otros tipos de diterpenoides. Los ésteres de ingenol son altamente tóxicos, constituyendo un aceite muy irritante y, aunque el ingenol por si solo, aislado en forma libre, es inofensivo, el aislamiento de ingenol a partir de dichos ésteres es técnicamente complejo y no exento de riesgo para la salud humana de los operarios que intervengan en dichas operaciones de aislamiento, debido a la susodicha toxicidad de la fracción de ésteres de ingenol.

En 1991 fue publicado un método para el aislamiento de ingenol a partir de semillas de E. lathyris [Bagavathi R. et al., Naturforsch. 1991;46b:1425-1433]. Dicho método consistía en separar la fracción que contiene los ésteres de ingenol mediante una serie de extracciones con solventes, tales como metanol, éter de petróleo y cloroformo, seguida de una adsorción selectiva en geles de sílica. A continuación la fracción que contenía los ésteres de ingenol se sometía a hidrólisis y finalmente el ingenol obtenido se purificaba mediante técnicas de cromatografía en columna. Dicho método de aislamiento de ingenol requería mucho tiempo y trabajo, debido al elevado número de pasos o etapas, siendo, por lo tanto, su rendimiento, bajo y dificultando así el desarrollo de nuevos derivados semisintéticos potencialmente utilizables como fármacos.

Para resolver el problema de la baja eficiencia y el bajo rendimiento del método descrito previamente en el estado de la técnica, para el aislamiento de ingenol, Appendino y cols. [Appendino G et al., J Nat Prod. 1999;62 (1) :76-9], desarrollaron un protocolo de extracción y aislamiento de ingenol más corto y menos tóxico, ya que el tiempo de contacto con el aceite irritante extraído de semillas de E. lathyris conteniendo los ésteres de ingenol y que también contiene los compuestos diterpenoides macrocíclicos, era menor que el descrito anteriormente. En dicho método, el aislamiento del ingenol a partir del aceite de semillas de E. lathyris se llevaba a cabo en tres pasos básicos. Brevemente, (1) la separación de una fracción cruda de diterpenoides,

(2) la hidrólisis de los factores Euphorbia-L1-L9, y (3) la separación del ingenol a partir de los polioles resultantes de la hidrólisis de los esteres diterpenoides macrocíclicos (latirol, epoxilatirol, 7-hidroxilatirol, isolatirol, jolkinol, etc…) . Ambas separaciones conllevan la purificación de una pequeña concentración de ingenol a partir de una mezcla compleja de compuestos naturales que tienen una polaridad similar, lo que se traduce en la obtención de un ingenol que, debido a la complejidad de la muestra en la que se encuentra embebido y a dicha similitud en la polaridad de los compuestos que forman la susodicha muestra, puede presentar impurezas, al estar contaminado con otras sustancias presentes en la mencionada mezcla, principalmente ésteres de ingenol sin hidrolizar o ésteres de otros diterpenoides macrocíclicos.

El problema técnico resuelto por la presente invención es un método, alternativo a los descritos en el estado de la técnica, de aislamiento de ingenol a partir de mezclas de ésteres de diterpenoides y de ésteres de ingenol. Estas mezclas pueden tener cualquier origen, bien natural (a partir de plantas) u originarse en un procedimiento de síntesis química. Preferentemente la invención aísla ingenol a partir de plantas del género Euphorbia y, más en concreto, a partir de semillas de E. lathyris.

Para resolver los problemas expuestos, existentes en el estado de la técnica, para el aislamiento de ingenol, la presente invención describe un método de aislamiento de dicho compuesto a partir de mezclas de ésteres diterpenoides y ésteres de ingenol, preferentemente producidas al procesar semillas de E. lathyris, con mayor rendimiento que los conocidos en el estado de la técnica, al simplificar el número de pasos necesario para dicho aislamiento, reduciéndolo a un único paso (con un paso adicional opcional de purificación) y obtener un ingenol con menor número de impurezas (pureza gt; 99%) .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Breve descripción de la invención El método descrito en la presente invención, combina en un único paso la hidrólisis del ingenol presente en la mezcla de ésteres diterpenoides y ésteres de ingenol y la separación de dicho ingenol de dicha mezcla. Para ello se lleva a cabo un tratamiento de dicha mezcla de ésteres diterpenoides y ésteres de ingenol con una solución de un disolvente orgánico, preferentemente tetrahidrofurano (THF) y agua acidificada, más preferentemente una salmuera (agua + sal) acidificada. El método descrito en la presente invención evita el aislamiento de intermedios tóxicos o irritantes, como la fracción de ésteres de ingenol, simplifica el proceso y los tiempos de purificación del ingenol y además, el rendimiento de obtención de dicho compuesto es muy superior a los conocidos hasta el momento en el estado de la técnica. Además, se obtiene un ingenol con menor concentración de impurezas, lo que hace al ingenol así aislado, más apropiado para ser el compuesto de partida en procesos para obtener derivados del mismo,... [Seguir leyendo]

1. Método de aislamiento de ingenol a partir de una mezcla de ésteres diterpenoides y ésteres de ingenol que combina, en un único paso, las etapas de hidrólisis de los ésteres de ingenol y extracción/aislamiento del ingenol de dicha mezcla.

2. Método según la reivindicación 1 en que la mezcla de ésteres diterpenoides y ésteres de ingenol se somete un único paso de tratamiento combinado, con una solución de agua acidificada y un disolvente orgánico.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en que la relación de agua acidificada y disolvente orgánico es 1:1.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en que el disolvente orgánico es THF.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en que el agua acidificada contiene sales inorgánicas.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en que el agua acidificada contiene NaCl.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado por que la solución de agua acidificada y disolvente orgánico está formada por una combinación de H2SO4 2N y H2O más NaCl al 35% peso/volumen, en una relación 1:1.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que, además comprende, una etapa adicional de purificación del ingenol aislado.

9. Método según la reivindicación 8 caracterizado porque la etapa de purificación del ingenol aislado se realiza mediante cromatografía en columna, por gravedad.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9 en que el ingenol aislado, opcionalmente purificado, se somete a un proceso adicional de semisíntesis química para producir un derivado en posición 3 seleccionado entre: Ingenol 3-tigliato, Ingenol 3-angelato o mezclas de los mismos.

11. Método según la reivindicación 10 en que el proceso adicional de semisíntesis química para la obtención de derivados de ingenol en posición 3, al que se somete al ingenol aislado, opcionalmente purificado, tiene como compuesto intermedio común al ingenol 5, 20-acetónido.

12. Método de aislamiento de ingenol a partir de material vegetal que comprende las etapas de:

a) Someter el material vegetal a agitación mecánica en una solución de metilato sódico metanólico. b) Neutralizar la reacción anterior con una solución de un ácido acético glacial o ácido perclórico. c) Filtrar o succionar la solución anterior. d) Lavar el pellet obtenido en la etapa previa con metanol. e) Concentrar el pellet mediante técnicas en vacío. f) Extraer del pellet la fracción que contiene los ésteres de ingenol, con éter petroleo. g) Aislar el ingenol del resto de compuestos contenidos en la fracción obtenida en la etapa anterior f) , mediante tratamiento con agua acidificada y THF. h) Opcionalmente, purificar el ingenol aislado

13. Método según la reivindicación 12 caracterizado por que el material vegetal son semillas de Euphorbia lathyris.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13 en el que la concentración de metilato sódico metanólico es 0.20 N y el tiempo a que se someten las semillas a agitación mecánica es de 4 horas.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 caracterizado por que la filtración o succión del paso c) se realiza sobre celite.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 caracterizado por que la solución de agua acidificada está formada preferentemente por una combinación de H2SO4 2N y H2O más NaCl al 35% peso/volumen, en una relación 1:1.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 caracterizado porque la etapa de purificación del ingenol se realiza mediante cromatografía en columna, por gravedad.

18. Método según la reivindicación 17 caracterizado por que se emplea una columna de sílica-gel como fase estacionaria, con una fase móvil éter de petróleo-etilacetato.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18 en que el ingenol aislado,

opcionalmente purificado, se somete a un proceso adicional de semisíntesis química para producir un derivado en posición 3 seleccionado entre: Ingenol 3-tigliato, Ingenol 3-angelato o mezclas de los mismos.

20. Método según la reivindicación 19 en que el proceso adicional de semisíntesis química para la obtención de derivados de ingenol en posición 3, al que se somete al ingenol aislado, opcionalmente purificado, tiene como compuesto intermedio común al ingenol 5, 20-acetónido.