Matrices de fibrina liofilizadas y métodos de preparación de las mismas.

Una matriz de fibrina porosa liofilizada está formada a partir de proteínas plasmáticas compuestas defibrinógeno,

trombina y factor XIII, la matriz contiene menos del 10% de humedad residual, sin agentesantifibrinolíticos exógenos añadidos y comprende menos de 1 mM de agentes quelantes orgánicos, donde lasproteínas plasmáticas comprenden menos del 20% de plasminógeno presente normalmente en el plasma.

Matrices de fibrina liofilizadas y métodos de preparación de las mismas

CAMPO TÉCNICO

La presente invención describe biomatrices liofilizadas compuestas de proteína plasmática sustancialmente libre de plasminógeno para aplicaciones clínicas como implantes para ingeniería tisular. Además, las biomatrices liofilizadas de proteína de plasma están sustancialmente libres de agentes antifibrinolíticos exógenos así como de agentes quelantes orgánicos. Las matrices, según la presente invención, tienen utilidad clínica, per se o como implantes portadores de células.

DISEÑO ANTERIOR

Ingeniería Tisular

La ingeniería de tejidos se puede definir como la técnica de reconstrucción o regeneración de tejidos en mamíferos, tanto estructural como funcionalmente (Hunziker, Osteoarth. Cart. 10:432-63, 2002) . La ingeniería tisular incluye, generalmente, la liberación de un soporte natural o sintético que sirve como soporte arquitectónico sobre el cual las células se pueden fijar, proliferar y sintetizar nuevos tejidos para la reconstrucción de una herida o defecto.

Un ejemplo de tejido propenso a sufrir daños a causa de dolencias y traumas es el cartílago articular, uno de los muchos tipos de cartílago del cuerpo, que podemos encontrar en la superficie de los huesos. Los daños en el cartílago pueden ser resultado de una enfermedad inflamatoria como la artritis reumatoide, de un proceso degenerativo como la osteoartritis o de un trauma como una fractura intraarticular o la consecutiva lesión de ligamentos. Las lesiones de cartílago están, a menudo, acompañadas de dolor y de movilidad reducida, generalmente no se curan y sin intervención médica pueden requerir la sustitución osteoarticular total.

Las estrategias terapéuticas actuales para reparar el cartílago dañado incluyen procedimientos que inducen una respuesta de reparación espontánea y aquellos que reconstruyen el tejido de manera estructural y funcional. Estas estrategias incluyen técnicas quirúrgicas que exponen al hueso subcondral, permitiendo así la infiltración de células progenitoras de médula ósea para iniciar la respuesta de reconstrucción. Con frecuencia, el tejido inducido es un tipo de fibrocartílago combinado sin durabilidad y cuyas mejoras clínicas son muy limitadas. La última estrategia incluye el trasplante de células o tejidos condrales u osteocondrales ya sean de origen autólogo o alogénico. El Trasplante autólogo de Condrocitos (TAC) se refiere al trasplante de condrocitos autólogos en una lesión de cartílago que ha sido aislada a partir de una biopsia del cartílago del paciente y expandida in vitro. De hecho, esta técnica requiere un complicado procedimiento que conlleva dos trabajos quirúrgicos y que muestra una enorme variabilidad y un éxito clínico limitado.

En esta disciplina, se sabe que las matrices son prácticas para la regeneración de tejidos así como para actuar como superficies biocompatibles para los mismos. Estas matrices pueden, además, ser consideradas como sustratos para el crecimiento de las células, ya sea in vitro o in vivo. Las matrices para el crecimiento tisular y/o la regeneración incluyen tanto entidades biodegradables como bioestables. Entre las múltiples posibilidades que se pueden utilizar como matrices de soporte para el crecimiento o la regeneración de tejidos se encuentran los geles, las espumas, las placas y ciertas estructuras porosas de diferente forma y tamaño.

En el pasado se han utilizado como apósitos o implantes materiales porosos formados a partir de materiales sintéticos y/o materiales biodegradables de origen natural. Un material poroso proporciona un soporte estructural y un soporte para el crecimiento intracelular y la regeneración tisular. Preferiblemente, el material poroso se degrada de manera gradual, siendo absorbido como tejido regenerado. Los materiales bioreabsorbibles que suelen utilizarse en la fabricación de apósitos porosos o implantes incluyen polímeros y biopolímeros sintéticos como pueden ser las proteínas estructurales y los polisacáridos. Los biopolímeros pueden ser seleccionados o modificados de manera que se modifiquen sus propiedades fisicoquímicas para proporcionar mayor flexibilidad o menor vulnerabilidad a la degradación.

Se ha descubierto que numerosos polímeros naturales son útiles en la ingeniería tisular o de cultivos, incluyendo distintos constituyentes de la matriz extracelular como la fibronectina, algunos tipos de colágeno y laminina, como la queratina, la fibrina y el fibrinógeno, el ácido hialurónico, el heparán sulfato y el sulfato de condroitina entre otros. Las patentes US 6, 425, 918 y 6, 334, 968 describen una esponja polisacárida liofilizada bioreabsorbible y su uso como matriz o soporte para ser implantada en un paciente.

Fibrina [0008] El fibrinógeno es una importante proteína plasmática que participa en el proceso de coagulación de la sangre. Una vez dañado el vaso sanguíneo, el fibrinógeno se convierte en fibrina insoluble que sirve como estructura para el coágulo. La coagulación de la sangre es un proceso complejo que comprende la interacción secuencial de un número de proteínas de plasma, en particular de fibrinógeno (factor I) , protrombina (factor II) , factor V y factores VII-

XIII. También forman parte de la formación de los coágulos sanguíneos otras proteínas plasmáticas como el factor de Von Willebrand, las inmunoglobulinas, los factores de coagulación y los componentes del complemento.

En esta disciplina, la fibrina se conoce como adhesivo tisular de uso médico eficaz para la reconstrucción de heridas y la reparación del tejido. El concentrado proteico liofilizado derivado del plasma (compuesto de fibrinógeno, factor XIII y fibronectina) , en presencia de trombina e iones de calcio da lugar a un sellador biológico inyectable (goma de fibrina) . La patente US 5, 411, 885 describe un método de incrustación y cultivo de tejidos con el uso de la goma de fibrina.

La patente US 4, 642, 120 explica el uso de gomas que contienen fibrinógeno en combinación con células mesenquimales autólogas o condrocíticas como método para favorecer la reparación de los defectos en cartílago y hueso. La patente US 5, 260, 420 describe un método para la preparación y el uso de pegamentos biológicos compuestos de proteínas plasmáticas de uso terapéutico. La patente US 6, 440, 427 describe un compuesto adhesivo formado en su mayor parte de componentes precursores de fibrina y de un polisacárido como el ácido hialurónico que mejora la viscosidad. Itokazu (Itokazu et al., Infection 25:359-63, 1997) describió un coágulo de fibrina liofilizada para la liberación prolongada de antibióticos.

La patente US 5, 972, 385 revela una matriz liofilizada de polisacárido de colágeno reticulado que se administra solo o en combinación con otros terapéuticos para la reparación de tejido. Las patentes US 5, 206, 023 y US 5, 368, 858 describen una composición de reparación de cartílago que consiste en una matriz biodegradable, una proliferación o y un factor de transformación.

En las patentes US 4, 442, 655 y EP 0068149 se describe una estructura de fibrinógeno liofilizado con estructura de malla que puede utilizarse para el tratamiento de heridas, como material de relleno de cavidades óseas o como soporte de sustancias activas para la liberación controlada. La estructura se prepara por la mezcla de fibrinógeno y solución de trombina, a continuación se verte en un molde, se congela y se liofiliza.

En las patentes US 6, 310, 267 y 6, 486, 377 se describe una membrana de fibrina liofilizada para la cicatrización de heridas. La preparación de esta membrana requiere una diálisis de una o varias etapas de la solución de fibrinógeno. Según esta divulgación, la diálisis de una o varias etapas de la solución de fibrinógeno cambia radicalmente su composición reduciendo la concentración de sales y aminoácidos. Esta diálisis se lleva a cabo en una solución acuosa de una sal inorgánica fisiológicamente compatible y un agente complejante orgánico.

En la patente WO 99/15209 se describe una esponja de fibrina que contiene un activador de coagulación de la sangre para hemostasis, adhesión de tejidos, cicatrización de heridas y cultivo celular. De acuerdo con esta publicación, la restauración de la humedad o el contenido de agua tras la liofilización es crucial para obtener una esponja suave, adaptable y absorbente. La esponja puede estar impregnada de aditivos tales que activadores de coagulación de la sangre, estabilizadores, conservantes y otros agentes.

Las patentes US 5, 466, 462 y 5, 700, 476 describen una esponja heteromófica bioreabsorbible compuesta de una matriz... [Seguir leyendo]

1. Una matriz de fibrina porosa liofilizada está formada a partir de proteínas plasmáticas compuestas de fibrinógeno, trombina y factor XIII, la matriz contiene menos del 10% de humedad residual, sin agentes antifibrinolíticos exógenos añadidos y comprende menos de 1 mM de agentes quelantes orgánicos, donde las proteínas plasmáticas comprenden menos del 20% de plasminógeno presente normalmente en el plasma.

2. Un método para la preparación de una matriz de fibrina porosa liofilizada que contiene menos del 10% de humedad residual, sin agentes antifibrinolíticos exógenos añadidos, que contiene menos de 1 mM de agentes quelantes orgánicos, y que comprende menos del 20% de plasminógeno presente normalmente en el plasma comprende los siguientes pasos:

Proporcionar una solución de trombina y una solución de proteína plasmática, la solución de proteína plasmática sin haber añadido agentes antifibrinolíticos exógenos añadidos, con menos de 1 mM de agentes quelantes orgánicos y que comprende menos del 20% de plasminógeno presente normalmente en el plasma. Introducir la solución de trombina y la solución de proteína plasmática en un soporte sólido o en un molde en presencia de iones de calcio. Incubar en las condiciones apropiadas para conseguir la coagulación. Congelar la mezcla coagulada. Liofilizar la mezcla coagulada para obtener una esponja.

3. El uso de una matriz de fibrina porosa liofilizada según la reivindicación 1 para la preparación de un implante para ser implantado en la zona de enfermedad o lesión para el tratamiento de un tejido enfermo o lesionado.

4. Una matriz de fibrina porosa liofilizada según la reivindicación 1, el método según la reivindicación 2 o el uso según la reivindicación 3, en el que las proteínas plasmáticas contienen menos del 10% del plasminógeno presente en el plasma normal.

5. Una matriz de fibrina porosa liofilizada según la reivindicación 1, el método según la reivindicación 2 o el uso según la reivindicación 3, en el que las proteínas plasmáticas contienen menos del 5% del plasminógeno presente normalmente en el plasma.

6. Una matriz de fibrina porosa liofilizada, método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las proteínas plasmáticas contienen proteínas purificadas a partir de una fuente plasmática.

7. Una matriz de fibrina porosa liofilizada, método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que además contiene al menos un aditivo seleccionado del grupo formado por polisacáridos, glicosaminoglicanos y polímeros sintéticos.

8. Una matriz de fibrina porosa liofilizada, método o uso según la reivindicación 7, en el que dicho glicosaminoglicano se selecciona a partir de ácido hialurónico reticulado y no reticulado.

9. Una matriz de fibrina porosa liofilizada, método o uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho glicosaminoglicano se selecciona a partir del grupo formado por heparina, heparina de bajo peso molecular, heparán sulfato o una combinación de los mismos.

10. Una matriz de fibrina porosa liofilizada, método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que contiene además al menos un agente bioactivo seleccionado de factores de crecimiento, citoquinas, plaquetas, sobrenadante de plaquetas, proteínas derivadas de las plaquetas, hormonas, analgésicos, agentes antiinflamatorios, agentes antimicrobianos y enzimas.

11. Una matriz de fibrina porosa liofilizada, método o uso según con la reivindicación 10, en el que dicho factor de crecimiento es un factor de crecimiento de fibroblastos seleccionado del grupo FGF-9, FGF-2, FGF-4, FGF-18 o una combinación de los mismos.

12. Una matriz de fibrina porosa liofilizada, método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que contiene además células.

13. Una matriz de fibrina porosa liofilizada, método o uso según la reivindicación 12 donde dichas células se seleccionan a partir de células madre, células progenitoras, condrocitos, osteoblastos, hepatocitos o tipos de células mesenquimales, endoteliales, epiteliales, uroteliales, endocrinas, neuronales, pancreáticas, renales y oculares.

14. Una matriz de fibrina porosa liofilizada, método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde al menos una de las proteínas plasmáticas es autóloga.

15. Una matriz de fibrina porosa liofilizada, método o uso según la reivindicación 14, en donde todas las proteínas del plasma son autólogas.

16. Una matriz de fibrina porosa liofilizada, método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde al menos una de las proteínas plasmáticas es recombinante.