Materiales de unión de proteínas del prión y métodos de uso.

Un método de detección y separación de una proteína priónica infecciosa,

PrPsc, de una muestra que comprendeponer en contacto la muestra con el material de unión de proteína del prión en condiciones que permiten laformación de un complejo entre la proteína del prión infecciosa y el material de unión de la proteína del prión, en elque el material de unión del prión comprende un grupo funcional, en el que el grupo funcional es un grupo funcionalhidrófilo, uno hidrófobo o uno anfifílico seleccionado del grupo que consiste en: -OCH2-CHOH-CH2NH2, -C6H5,-(CH2)3-CH3, -CH2-CH2-N+H(CH3)2, -CH2-CH2-N+(CH3)3, un grupo dimetilaminoetilo y un grupo trimetilaminoetilo.

Materiales de unión de proteínas del prión y métodos de uso.

Campo de la invención Esta invención se refiere al campo de la unión de proteínas y más en particular se refiere a materiales que se unen a proteínas del prión y métodos para usar los materiales de unión de proteínas del prión para detectar o retirar priones de muestras biológicas.

Antecedentes de la invención La proteína del prión natural o celular quot;PrPcquot; está ampliamente distribuida por todos los mamíferos y tiene una secuencia de aminoácidos y estructura de proteínas particularmente bien conservada. Se cree que los priones infecciosos constan de una forma modificada de la proteína del prión celular normal (PrPc) y se denominan quot;PrPscquot;. Los priones presentan algunas propiedades en común con otros patógenos infecciosos, pero no parecen contener ácido nucleico. En su lugar, se propone que está implicado un cambio conformacional postraduccional en la conversión de PrPc no infecciosa en PrPsc infecciosa durante el que se transforman !-hélices en β-láminas. La PrPc contiene tres !-hélices y presenta estructura de pocas β-láminas; por el contrario, la PrPsc es rica en β-lámina. Se cree que la conversión de PrPc en PrPsc conduce al desarrollo de encefalopatías espongiformes transmisibles (las TSE) durante el que se acumula PrPsc en el sistema nervioso central y va acompañado de cambios neuropatológicos y disfunción neurológica. La PrPsc, con frecuencia referida como la forma de quot;tembladeraquot; de la proteína priónica, se considera necesariamente y posiblemente suficiente, para la transmisión y la patogenia de estas enfermedades neurodegenerativas transmisibles de animales y seres humanos.

Ejemplos específicos (por sus siglas en inglés) de las TSE incluyen tembladera, que afecta a ovejas y cabras; encefalopatía espongiforme bovina (BSE) ; encefalopatía transmisible del visón, encefalopatía transmisible felina y enfermedad debilitante crónica (CWD) . En seres humanos, las enfermedades TSE se pueden presentar como kuru, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) , Síndrome de Gerstmann-Straüssler-Scheinker (GSS) , insomnio fatal y enfermedad de Creutzfeldt-Jakob variante (vCJD) . Recientemente surgió vCJD en seres humanos como resultado de la epidemia de BSE en Gran Bretaña y está causada lo más probablemente por el consumo de productos alimenticios procedentes de ganado infectado con BSE o quot;enfermedad de las vacas locasquot;. Un número desconocido de personas en el Reino Unido ingirió alimentos potencialmente contaminados con tejido nervioso de ganado infectado por BSE durante mediados de los años 80 a principios de los años 90. Debido a que el periodo de incubación para la enfermedad contraída de manera oral puede ser mayor que 20 años en seres humanos, la verdadera frecuencia de vCJD puede no ser evidente durante muchos años. Hasta la fecha, se sabe que más de 150 personas han contraído la enfermedad, principalmente en el Reino Unido; sin embargo, se han indicado casos en Canadá, Francia, Hong Kong, Irlanda, Italia y los Estados Unidos. La exportación de productos alimenticios bovinos contaminados del Reino Unido en el mundo indica una posible presencia global de BSE y por lo tanto la probabilidad de vCJD. Concuerda con estas observaciones la detección de BSE en la mayoría de los países europeos, Japón, Canadá, Estados Unidos e Israel. Por consiguiente, la capacidad para detectar y retirar proteína del prión infecciosa de una variedad de materiales incluyendo productos alimenticios es de gran importancia.

Una característica de todas las TSE es la ausencia de una respuesta inmunitaria del huésped medible al agente. Por consiguiente, no se han identificado en la actualidad anticuerpos específicos para las TSC. Por otra parte, la ausencia de una secuencia de ácidos nucleicos conocida excluye el uso de métodos de diagnóstico basados en la reacción en cadena de la polimerasa. Así, no se puede usar ningún ensayo serológico convencional para identificar animales infectados. Recientemente, se han usado técnicas con base inmunológica mejoradas para identificar PrPsc en cerebros de animales sacrificados.

Además de ingestión de productos infectados de origen bovino, la transfusión de sangre y el trasplante de órganos representan otro modo de transmisión de vCJD entre seres humanos. El riesgo de capacidad de transmitirse de vCJD en seres humanos por transfusión de sangre es desconocido en la actualidad, pero basándose en los datos de modelos animales experimentales que incluyen la transmisión de ovejas infectadas de manera experimental por vía oral con BSE y ovejas infectadas de manera natural con tembladera, parece ser una posibilidad muy probable y ya se ha justificado lo más probablemente para una transmisión de ser humano a ser humano de vCJD. A pesar de otras TSE humanas, la PrPsc está presente en el sistema linforreticular de pacientes de vCJD, aumentando de ese modo la probabilidad de que el agente infeccioso esté en la sangre y su transmisión por transfusión de sangre. Otros factores que elevan la preocupación por el riesgo de transmisión por transfusión incluyen los números desconocidos, pero presumiblemente altos, de personas expuestas a BSE y ausencia de un ensayo de diagnóstico preclínico para vCJD. Por otra parte, la virulencia de vCJD parece estar aumentada después de la adaptación de la especie en primates y ratones sugiriendo que la transmisión de ser humano a ser humano puede ser más eficaz que vaca a ser humano. Así, hay una urgente necesidad de métodos para evitar la transmisión de vCJD por transfusión de sangre. Dichas medidas pueden incluir la identificación temprana de donadores infectados y su suspensión, eliminación e inactivación de agentes de TSE en alimentos procedentes de animales y productos para la salud destinados a consumo de animales o seres humanos o aplicaciones, productos procedentes de sangre humana y bovina y trasplante de órganos. Desafortunadamente, la infecciosidad de TSE es notablemente resistente a métodos químicos y físicos de inactivación y un método selectivo de inactivación es impreciso.

Se ha identificado una serie de materiales que se unen a proteína priónica. Se han investigado en bibliotecas de péptidos combinatorios ligandos que se unen a la secuencia de repetición de octapéptidos (PHGGGWGQ) (SEC ID Nº 1) encontrados en todas las proteínas del prión de mamíferos conocidas y se descubrió una serie de ligandos, 5 como se describe en la patente internacional WO 0177687. Otros materiales incluyen ligandos que interactúan con placa amiloide, por ej., Rojo Congo (Ingrosso, L., et al., Congo Red Prolongs the Incubation Period in Scrapieinfected Hamsters. J. Virology 69: 506-508 (1.995) ) ; 4-yodo, 4-desoxidoxorubicina (Tagliavini, F., et al., Effectiveness of Anthracycline Against Experimental Prion Diseases in Syrian Hamsters. Science 276: 1.119-1.122 (1.997) ) ; amfotericina B, porfirinas y ftalocianinas (Priola, S. A., et al., Porphyrin and Phtalocyanine Antiscrapie Compounds, 10 Science 287: 1.503-1.506 (2.000) ) ; metales (Stockel et al., Biochemistr y , 37, 7.185-7.193 (1.998) ) ; péptidos que interactúan con PrP para formar complejos (véase la Patente de EE.UU. 5.750.361 para Prusiner et al. y Soto, C. et al., Reversion of Prion Protein Conformational Changes in Synthetic β-sheet Breaker Peptides, Lancet, 355: 192-197 (2.000) ) ; heparina y otros polianiones polisulfatados (Caughey, B., et al., Binding of the Protease-sensitive Form of Prion Protein PrP to Sulphated Glycosaminoglycan and Congo Red, J. Virology 68: 2.135-2.141 (1.994) ) ; anticuerpos 15 (Kascsak, R. J., et al., Immunodiagnosis of Prion Disease, Immunological Invest. 26: 259-268 (1.997) ) y otras proteínas, por ej., plasminógeno (Fischer, M. B. et al., Binding of Disease-associated Prion Protein to Plasminogen., Nature 408: 479-483 (2.000) ) . Se ha usado cromatografía de intercambio iónico para purificar componentes sanguíneos, tales como hemoglobina, de contaminación priónica (Patente de EE.UU. Nº 5.808.011 para Gawr y l et al.) . Sin embargo, el material cromatográfico explicado por Gawr y l et al., se une a la hemoglobina y la hemoglobina purificada se recoge con posterioridad por elución en gradiente. En la actualidad, no se ha caracterizado completamente o encontrado ningún material que pueda unirse a prión de una amplia variedad de medios.

Hasta la fecha, las enfermedades TSE humanas son fatales al 100%. Desafortunadamente, incluso aunque se ha indicado una serie de compuestos incluyendo amfotericinas, polianiones sulfatados, colorante Rojo Congo y antibióticos de antraciclina como agentes terapéuticos futuros, todos han demostrado sólo un modesto potencial

para dificultar la propagación de... [Seguir leyendo]

1. Un método de detección y separación de una proteína priónica infecciosa, PrPsc, de una muestra que comprende poner en contacto la muestra con el material de unión de proteína del prión en condiciones que permiten la formación de un complejo entre la proteína del prión infecciosa y el material de unión de la proteína del prión, en el

que el material de unión del prión comprende un grupo funcional, en el que el grupo funcional es un grupo funcional hidrófilo, uno hidrófobo o uno anfifílico seleccionado del grupo que consiste en: -OCH2-CHOH-CH2NH2, -C6H5, - (CH2) 3-CH3, -CH2-CH2-N+H (CH3) 2, -CH2-CH2-N+ (CH3) 3, un grupo dimetilaminoetilo y un grupo trimetilaminoetilo.

2. El método según la reivindicación 1, en el que el material de unión comprende aluminio o sílice.

3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el material de unión comprende una matriz 10 polimérica.

4. El método según la reivindicación 3, en el que la matriz polimérica es un polimetacrilato o un metacrilato.

5. El método según la reivindicación 3, en el que la matriz polimérica es una resina de polimetacrilato.

6. El método según la reivindicación 3, en el que la matriz polimérica es una resina de hidroxilpolimetacrilato.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el grupo funcional e.

15. OCH2-CHOH-CH2NH2.

8. El método según cualquier reivindicación precedente, en el que el material de unión está en forma de perla.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la muestra es una muestra biológica, un producto alimenticio, una muestra medioambiental o una muestra de agua.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la muestra comprende hasta 50% de 20 albúmina de suero en peso.