Marcadores de metilación del ADN asociados con el fenotipo metilador de islas CpG (CIMP) en el cáncer colorrectal humano.

Procedimiento para la detección y/o clasificación de un trastorno o enfermedad proliferativa celular del colon conCIMP en un individuo,

que comprende: determinar el nivel de expresión del gen NEUROG1 o una secuenciagenómica seleccionada de entre el grupo constituido por las SEQ ID N.o 138, 124 y 110 en una muestra biológicaaislada de dicho individuo, en la que la metilación de CpG y/o la infraexpresión es indicativa de la presencia o clasede trastorno o enfermedad proliferativa del colon con CIMP, como, por ejemplo, carcinoma colorrectal.

Marcadores de metilación del ADN asociados con el fenotipo metilador de islas CpG (CIMP) en el cáncer colorrectal humano.

Campo de la invención Aspectos de la presente invención se refieren de forma general al cáncer y al cáncer colorrectal, y más en particular a la identificación, y a la utilización como medio de diagnóstico y/o pronóstico de nuevos marcadores validados de metilación del ADN asociados con el fenotipo metilador de islas CpG (CIMP) en el cáncer colorrectal. La presente invención también se refiere a secuencias de ADN genómico que muestran patrones de expresión alterados en estados morbosos en comparación con el estado normal. Determinadas formas de realización proporcionan, entre otros, procedimientos, ácidos nucleicos, matrices de ácidos nucleicos y kits novedosos útiles para detectar, o para detectar y diferenciar el CIMP y/o trastornos proliferativos celulares. Preferentemente, los procedimientos, ácidos nucleicos, matrices de ácidos nucleicos y kits para la detección y diagnóstico de trastornos proliferativos celulares son utilizados para el diagnóstico del CIMP, y en particular del cáncer colorrectal.

Referencias cruzadas a las solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad para la solicitud de patente provisional de Estados Unidos n.o de serie 60/677, 181, presentada el 2 de mayo de 2005 y titulada "DNA METHYLATION MARKERS ASSOCIATED WITH THE Isla CpG METHYLATOR PHENOTYPE (CIMP) IN HUMAN COLORECTAL CANCER” [MARCADORES DE METILACIÓN DEL ADN ASOCIADOS CON EL FENOTIPO METILADOR DE ISLAS CpG (CIMP) EN EL CÁNCER COLORRECTAL HUMANO].

Lista de secuencias Una lista de secuencias, conforme a la norma 37 C.F.R. § 1.52 (e) (5) , ha sido facilitada como parte de esta solicitud en un disco compacto (1 de 1) en forma de un archivo de texto de 6, 02 MB, titulado "47675- 189 Sequence Listing.txt" ("180_0001.txt") y que se incorpora íntegramente como referencia a la presente memoria.

Antecedentes Epigenética del cáncer La epigenética se refiere a un cambio en los estados fenotípicos que no se basa en un cambio del genotipo, como puede ser una mutación, sino que es el resultado de un cambio en la actividad génica sin ninguna alteración acompañante de la secuencia de ADN. En palabras sencillas, equivale a un cambio estable en la expresión génica. En la epigenética del cáncer, la situación más frecuente consiste en un cambio en un gen transcripcionalmente activo que pasa a un estado "silenciado" a través de mecanismos epigenéticos. Las alteraciones epigenéticas se diferencian de los cambios transitorios en la regulación génica en que implican cambios estables relativamente amplios en la estructura de la cromatina, la modificación de las histonas, la composición de las proteínas asociadas y, en muchos casos, la alteración de la distribución de la metilación de la citosina-5 del ADN en los dinucleótidos CpG situados, por ejemplo, en la región promotora del gen. De todos esos mecanismos moleculares, la metilación del ADN es la más fácil de medir en muestras conservadas, porque la metilación de las citosinas se conserva en el ADN genómico que ha sido sometido, por ejemplo, a fijación con formol y ha pasado años conservado en bloques de parafina antes de extraer cortes de la preparación. Aun fuertemente degradado, el ADN entrelazado puede ser sometido con éxito al análisis de la metilación con, por ejemplo, la técnica del bisulfito (p. ej., con Amplicónes de PCR, como es la técnica MethyLight™) .

Las principales dianas del silenciamiento génico epigenético en las células cancerosas son las regiones promotoras que contienen segmentos de ADN ricos en G:C y CpG, llamados "islas CpG". Las islas CpG son segmentos de ADN genómico ricos en G:C y CpG, con frecuencia situados en la vecindad de genes, y que en general no están metilados en los tejidos somáticos normales. La metilación aberrante de las islas CpG ha sido documentada, por ejemplo, en tumores colorrectales humanos benignos y malignos y ha sido asociada con el silenciamiento génico.

Es importante destacar, sin embargo, que no todos los genes epigenéticamente silenciados de las células cancerosas son genes supresores de tumores, y que muchas de las islas CpG afectadas ni siquiera están localizadas en regiones promotoras, y no se cree que afecten a la expresión génica (p. ej., pueden hallarse en regiones promotoras de genes que no se expresan ni en células normales ni cancerosas de un órgano para dar lugar a una neoplasia maligna) . Con todo, la aparición de episodios de hipermetilación en las islas CpG es en muchos casos específica del cáncer, lo cual sugiere un escenario en que el porcentaje total de hipermetilación de las islas CpG durante la oncogénesis debe ser lo suficientemente alto para generar los daños necesarios en loci clave, pero que al mismo tiempo podría afectar a muchos otros loci no relacionados.

El CIMP en el cáncer colorrectal: incertidumbres e incongruencias de las técnicas previas. Se ha descrito un subtipo de tumores colorrectales que presentan un número inusualmente elevado de islas CpG hipermetiladas, que ha llevado a la definición de un fenotipo diferente, denominado "fenotipo metilador de islas CpG" o CIMP (16, 21) . El

cáncer colorrectal presenta una incidencia de 1 entre 20 y los tumores con CIMP suponen como mínimo el 15% de los casos, lo cual representa una cohorte grande de pacientes afectados. El cáncer colorrectal se ha considerado tradicionalmente una enfermedad monotípica a efectos del tratamiento, pero datos recientes apuntan a que existen diferentes desenlaces en subgrupos con características moleculares diferentes. Se ha descrito que los tumores colorrectales CIMP+ presentan diferentes perfiles de alteraciones genéticas, sublocalización anatómica, prevalencia de género, características histopatológicas y comportamiento clínico.

No obstante, dos factores complejos han dificultado la comprensión clara del fenómeno CIMP. En Cebador lugar, la compleja relación entre el CIMP y la inestabilidad de los microsatélites sigue provocando perspectivas dispares sobre la cuestión (38, 77) . En segundo lugar, el concepto de que el CIMP solo afecta a un subtipo de tumores colorrectales y a un subgrupo de islas CpG, en contraposición a todas las islas CpG reconocidas como susceptibles a la hipermetilación, no es aceptado ni entendido de forma universal (38) , y además se ve complicado por el hecho de que no existen criterios claros para reconocer qué islas CpG pertenecen al grupo de CIMP. En la bibliografía no aparece ningún panel inicial de marcadores de islas CpG metiladas que sean específicas del cáncer (21) , ni parece que todos los genes metilados específicamente en el cáncer estén afectados por el CIMP. No obstante, parece claro que ciertas islas CpG son más proclives a la hipermetilación específica del cáncer que otras. Así pues, la carencia de uniformidad en los procedimientos de clasificación utilizados para definir el CIMP ha provocado conclusiones diversas y contradictorias en lo que concierne, por ejemplo, a la asociación del CIMP con un antecedente familiar de cáncer, e incluso a la propia existencia del CIMP como un subtipo diferente de tumor colorrectal. No sólo ha habido cierta ambigüedad en la definición de las islas CpG que pertenecen al subtipo CIMP, sino también una carencia de un criterio uniforme para aplicar este subtipo a la definición del estado de CIMP. La existencia de mecanismos etiológicos y patogenéticos exclusivos del CIMP sólo se podrá definir cuando este subtipo pueda ser identificado con claridad y precisión. A día de hoy no existen directrices claras sobre lo que constituye y lo que no constituye islas CpG asociadas al CIMP.

Por consiguiente, existe una necesidad acusada en la técnica de dilucidar y entender la epidemiología y la etiología de las alteraciones de la metilación del ADN en el cáncer colorrectal humano, así como de esclarecer las incertidumbres relativas a la existencia del CIMP y su clasificación. Existe una necesidad acusada en la técnica no sólo de confirmar inequívocamente la existencia del CIMP como un subtipo diferente de cáncer colorrectal, sino también de crear un panel de clasificación mejorado de los marcadores de metilación del CIMP. Existe una necesidad acusada en la técnica de proporcionar composiciones y procedimientos para determinar la relación entre el estado de CIMP y las características moleculares, demográficas e histopatológicas, así como con factores de riesgo ambientales. Existe una necesidad acusada en la técnica de entender la patogenia de este subtipo de cáncer colorrectal y su asociación con factores de riesgo con el fin de estar mejor preparados para prevenir su aparición. Existe... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la detección y/o clasificación de un trastorno o enfermedad proliferativa celular del colon con CIMP en un individuo, que comprende: determinar el nivel de expresión del gen NEUROG1 o una secuencia genómica seleccionada de entre el grupo constituido por las SEQ ID N.o 138, 124 y 110 en una muestra biológica aislada de dicho individuo, en la que la metilación de CpG y/o la infraexpresión es indicativa de la presencia o clase de trastorno o enfermedad proliferativa del colon con CIMP, como, por ejemplo, carcinoma colorrectal.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cáncer colorrectal con CIMP se distingue del cáncer colorrectal sin CIMP, estando dicho procedimiento caracterizado porque la infraexpresión y/o la presencia de metilación de CpG es indicativa de la presencia de un cáncer colorrectal con CIMP y la ausencia o ausencia relativa de las mismas es indicativa de la presencia de un cáncer colorrectal sin CIMP.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que el nivel de expresión se determina detectando la presencia, ausencia o nivel de ARNm transcrito de dicho gen respectivo, o detectando la presencia, ausencia o nivel de un polipéptido respectivo codificado por dicho gen o secuencia del mismo, o en el que dicha expresión se determina detectando la presencia o ausencia de metilación de CpG dentro de dicho gen, en el que la presencia de metilación indica la presencia de un trastorno o enfermedad proliferativa celular del colon con CIMP.

4. Procedimiento para la detección y/o clasificación de un trastorno o enfermedad proliferativa celular del colon con CIMP en un individuo, que comprende:

poner en contacto el ADN genómico aislado de una muestra biológica obtenida de dicho individuo con al menos un reactivo, o series de reactivos, preferentemente un reactivo seleccionado de entre el grupo que comprende bisulfito, hidrogenosulfito, disulfito, y combinaciones de los mismos, que distingue entre dinucleótidos CpG metilados y sin metilar en al menos una región diana del ADN genómico,

en el que la región diana comprende, o se hibrida en condiciones restrictivas con una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de al menos una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEQ ID N.o 138, 124 y 110, respectivamente, comprendiendo dichos nucleótidos contiguos al menos una secuencia dinucleotídica CpG.

5. Procedimiento para la detección y/o clasificación de un trastorno o enfermedad proliferativa celular del colon con CIMP, que comprende:

a) extraer o aislar ADN genómico a partir de una muestra biológica obtenida del individuo;

b) tratar el ADN genómico, o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina que no están metiladas en su posición 5 en uracilo o en otra base que puede detectarse de forma distinta a la citosina en términos de propiedades de hibridación, preferentemente un reactivo seleccionado de entre el grupo que comprende bisulfito, hidrogenosulfito, disulfito, y combinaciones de los mismos;

c) poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificación y al menos un cebador que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos que es complementaria de, o que se hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID N.o 190, 191, 246, 247, 162, 163, 218 y 219, y secuencias complementarias de las mismas, siendo el ADN genómico tratado o el fragmento tratado del mismo o bien amplificado para producir al menos un fragmento amplificado, o bien no amplificado; y

d) determinar, basándose en la presencia o ausencia de, o en una propiedad de dicho fragmento amplificado, el estado o nivel de metilación de al menos un dinucleótido CpG de una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEQ ID N.o 138, 124 y 110, o una media, o un valor que refleje un estado o nivel medio de metilación de una pluralidad de dinucleótidos CpG de una secuencia seleccionada de entre los grupos constituidos por las SEQ ID N.o 138, 124 y 110.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, que comprende además, para la determinación, la utilización de al menos una molécula de ácido nucleico o molécula de péptido-ácido nucleico que comprende en cada caso una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria de, o que se hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEQ ID N.o 190, 191, 246, 247, 162, 163, 218 y 219, y secuencias complementarias de las mismas, suprimiendo dicha molécula de ácido nucleico o molécula de péptido-ácido nucleico la amplificación del ácido nucleico al que está hibridado.

7. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la determinación comprende la hibridación de al menos una molécula de ácido nucleico o molécula de péptido-ácido nucleico que comprende en cada caso una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria de, o se hibrida en condiciones

moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEQ ID N.o 190, 191, 246, 247, 162, 163, 218 y 219, y secuencias complementarias de las mismas.

8. Procedimiento para la detección y/o clasificación de un trastorno o enfermedad proliferativa celular del colon con CIMP, que comprende:

a) extraer o aislar ADN genómico a partir de una muestra biológica obtenida de un individuo;

b) digerir el ADN genómico o un fragmento del mismo con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación;

c) poner en contacto el ADN digerido con enzimas de restricción con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores aptos para la amplificación de la secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de una secuencia seleccionada de entre las SEQ ID N.o 138, 124 y 110; y

d) determinar, basándose en la presencia o ausencia de un fragmento amplificado, el estado o nivel de metilación de al menos un dinucleótido CpG de una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEQ ID N.o 138, 124 y 110.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la presencia o ausencia de un fragmento amplificado se determina mediante la hibridación de al menos un ácido nucleico o péptido-ácido nucleico que es idéntico, complementario, o se hibrida en condiciones restrictivas o muy restrictivas con un segmento contiguo de al menos 16 bases de longitud de una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEQ ID N.o 138, 124 y

110.

10. Ácido nucleico químicamente modificado derivado de una secuencia genómica seleccionada de entre las SEQ. ID N.o 138, 124 y 110, en el que la modificación química ha convertido al menos una base citosina sin metilar de la secuencia de ADN genómico en uracilo u otra base que se puede detectar como distinta de la citosina en términos de hibridación, o un ácido nucleico, que comprende al menos 50, preferentemente 16, nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN químicamente modificada seleccionada de entre el grupo constituido por las SEQ ID N.o 190, 191, 246, 247, 162, 163, 218 y 219, y secuencias complementarias de las mismas para su utilización en el diagnóstico, pronóstico, detección y/o clasificación de un trastorno o enfermedad proliferativa celular del colon con CIMP.

11. Utilización de un kit para el diagnóstico, pronóstico, detección y/o clasificación de un trastorno o enfermedad proliferativa celular del colon con CIMP, en el que dicho kit comprende.

a) una pluralidad de oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridarse en condiciones restrictivas o moderadamente restrictivas con los productos de transcripción del gen NEUROG1 o una secuencia genómica seleccionada de entre el grupo constituido por las SEQ ID N.o 138, 124 y 110,

b) un recipiente apto para contener los oligonucleótidos o polinucleótidos y una muestra biológica del paciente que comprende los productos de transcripción, en el que los oligonucleótidos o polinucleótidos pueden hibridarse en condiciones restrictivas o moderadamente restrictivas con los productos de transcripción,

c) unos medios para detectar la hibridación de (b) ; y opcionalmente,

d) unas instrucciones para la utilización y la interpretación de los resultados del kit.

12. Utilización de un kit para el diagnóstico, pronóstico, detección y/o clasificación de un trastorno o enfermedad proliferativa celular del colon con CIMP, en la que dicho kit comprende a) unos medios para detectar polipéptidos del gen NEUROG1;

b) un recipiente apto para contener dichos medios y la muestra biológica del paciente que comprende los polipéptidos, en el que los medios pueden formar complejos con los polipéptidos;

c) unos medios para detectar los complejos de (b) .

13. Utilización de un kit para el diagnóstico, pronóstico, detección y/o clasificación de un trastorno o enfermedad proliferativa celular del colon con CIMP, en la que dicho kit comprende a) un reactivo bisulfito;

b) un recipiente apto para contener dicho reactivo bisulfito y la muestra biológica del paciente;

c) al menos un juego de oligonucleótidos, que contiene dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso son idénticas, son complementarias, o se hibridan en condiciones restrictivas o muy restrictivas con un segmento de 9 o más preferentemente de 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEQ ID N.o 190, 191, 246, 247, 162, 163, 218 y 219.

14. Utilización de un kit para el diagnóstico, pronóstico, detección y/o clasificación de un trastorno o enfermedad proliferativa celular del colon con CIMP, en el que dicho kit comprende a) un reactivo de enzima de restricción sensible a la metilación; 10 b) un recipiente apto para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente;

c) al menos un juego de oligonucleótidos, uno o una pluralidad de ácidos nucleicos o péptidos-ácidos nucleicos que son idénticos, son complementarios, o se hibridan en condiciones restrictivas o muy restrictivas con un 15 segmento de al menos 9 bases de longitud de una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por

las SEQ ID N.o 138, 124 y 110; y, opcionalmente d) unas instrucciones para la utilización y la interpretación de los resultados del kit.

15. Utilización de un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 9 para el diagnóstico, pronóstico, detección y/o clasificación de un trastorno o enfermedad proliferativa celular del colon con CIMP.