Mamíferos no humanos productores de anticuerpos.

Un mamífero murino transgénico que comprende, integrado en su genoma,

una molécula de ácido nucleico quecontiene una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada, en el que dicha cadenaligera es capaz de emparejarse con al menos dos cadenas pesadas diferentes codificadas por el mamífero murino,de tal manera que la variedad en la especificidad de anticuerpos está conservada a través de reordenamientos ehipermutaciones en las cadenas pesadas, y en el que dicha cadena ligera comprende adicionalmente una regiónconstante de cadena ligera murina.

Mamiferos no humanos productores de anticuerpos Campo tecnico La invencion se refiere a la produccion y al uso de animales no humanos capaces de producir anticuerpos, o derivados de los mismos, que se expresan a partir de acidos nucleicos al menos parcialmente exogenos (transgenes) . Se describen transgenes para producir dichos animales transgenicos y procedimientos para producir dichos anticuerpos heterologos; procedimientos y vectores para producir dichos animales transgenicos.

Antecedentes de la invención Los linfocitos B median en la inmunidad humoral produciendo anticuerpos especificos. La subunidad estructural

basica de un anticuerpo (Ab) es una molecula de inmunoglobulina (Ig) . Las moleculas de Ig constan de un complejo de dos cadenas polipeptidicas ligeras (L) identicas y dos pesadas (H) identicas. En el extremo amino de cada cadena H y cadena L hay una region que varia en la secuencia de aminoacidos denominada region variable (V) . La parte restante de las cadenas H y L es relativamente constante en la secuencia de aminoacidos y se denomina region constante (C) . En una molecula de Ig, las regiones V de cadena H y L (VH y VL) se yuxtaponen para formar el

posible sitio de union a antigeno. Los genes que codifican las regiones V de cadena H y L se ensamblan somaticamente a partir de segmentos de ADN de la linea germinal durante la diferenciacion de linfocitos B precursores (pre-B) : segmentos genicos V, D y J para la cadena H y segmentos genicos V y J para la cadena L. Dentro de las regiones V de Ig existen tres regiones de mayor variabilidad de secuencia de aminoacidos que interaccionan para formar el sitio de reconocimiento del antigeno y por tanto se denominan regiones determinantes de complementariedad (CDR) .

El segmento genico V codifica la mayor parte del dominio de la region V, incluyendo la CDR1 y CDR2. La diversidad en la CDR1 y CDR2 deriva de la heterogeneidad de secuencias entre multiples segmentos V codificados por diferentes lineas germinales. La CDR3 se codifica por secuencias que estan formadas por la union de segmentos genicos V, D y J de la cadena H y segmentos V y J de la cadena L y por mecanismos que crean heterogeneidad de secuencia de nucleotidos donde se combinan estos segmentos. Diversidad adicional puede derivar del emparejamiento de regiones V de cadena H y L diferentes. En su conjunto estos procesos producen un repertorio primario de anticuerpos codificados por segmentos genicos de la linea germinal y expresados por linfocitos B recien formados.

Una fuente adicional de diversidad de anticuerpos esta impuesta por encima de la diversidad generada por

recombinacion de segmentos genicos de Ig. Los linfocitos B pueden introducir mutaciones en las regiones V del anticuerpo que expresan, un proceso denominado hipermutacion somatica. Por tanto, cuando un animal se encuentra por primera vez con un antigeno, el antigeno se une a un linfocito B especifico que sucede que lleva anticuerpos que tienen un dominio V que se une al antigeno. Esta respuesta primaria puede activar a este linfocito B para que continue segregando el anticuerpo afin. Estos linfocitos B activados tambien pueden dirigir ahora un proceso de mutacion somatica en sus segmentos genicos de anticuerpo reordenados y por tanto permitir la produccion de celulas hijas que producen variantes de los anticuerpos de la respuesta primaria. Un proceso de seleccion amplifica aquellos descendientes de linfocitos T variantes que constituyen un anticuerpo de afinidad mejorada por el antigeno. En linfocitos B, las hipermutaciones somaticas se dirigen a una region genomica limitada incluyendo los dos genes VH y VL reordenados. Por tanto la mutacion somatica permite la maduracion por afinidad,

la produccion y la seleccion de anticuerpos de alta afinidad. Por lo tanto, la mutacion somatica es importante para la generacion de anticuerpos de alta afinidad.

La especificidad exquisita y la alta afinidad de los anticuerpos y el descubrimiento de la tecnologia de hibridoma que permite la generacion de anticuerpos monoclonales (mAb) ha generado grandes expectativas para su utilizacion como agentes terapeuticos diana para enfermedades humanas. Los mAb son identicos porque estan producidos por 45 un solo linfocito B y su progenie. Los mAb se preparan fusionando los esplenocitos de un raton que se ha inmunizado con el antigeno deseado con celulas de mieloma para generar hibridomas inmortalizados. Uno de los mayores impedimentos enfrentados con el desarrollo de aplicaciones in vivo para los mAb en seres humanos es la inmunogenicidad intrinseca de las Ig no humanas. Los pacientes que responden a dosis terapeuticas de mAbs de raton fabricando anticuerpos contra las secuencias de Ig de raton (Anticuerpos Humanos Anti-raton; HAMA) ,

ocasionan toxicidad aguda, alteran su biodistribucion y aceleran la eliminacion, reduciendo de este modo la eficacia de administraciones posteriores (Mirick, y col., (2004) Q. Nucl. Med. Mol. Imaging 48, 251-257) .

Para rodear la generacion de HAMA, se han desarrollado procedimientos de humanizacion de anticuerpos en un intento para producir mAbs con menor inmunogenicidad cuando se aplican a seres humanos. Estos intentos han producido diversas estrategias basadas en ADN recombinante orientadas a aumentar el contenido de secuencias de 55 aminoacidos humanas en los mAb conservando al mismo tiempo la especifidad y afinidad del anticuerpo no humano parental. La humanizacion comenzo con la construccion de mAb quimericos raton-ser humano (Morrison, S. L., y col., (1984) . Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos., 81, 6851-5) , en los que las regiones C de la Ig en los mAb murinos se reemplazaron por regiones C humanas. Los mAb quimericos contienen el 60-70 % de las secuencias de 2 5

aminoacidos de ser humano y son considerablemente menos inmunogenicos que sus homologos murinos cuando se inyectan en seres humanos, a pesar de observarse aun una respuesta de anticuerpo antiquimerico humano (Hwang,

W. Y., y col. (2005) . Methods, 36, 3-10) .

En intentos para humanizar adicionalmente mAb murinos, se desarrollo el injerto de CDR. En el injerto de CDR, los anticuerpos murinos se humanizan injertando sus CDR sobre los armazones VL y VH de moleculas de IgG humana, conservando al mismo tiempo los restos marco conservados murinos considerados como esenciales para la especifidad y afinidad (Jones, P.T., y col., (1986) . Nature, 321, 522) .

En conjunto, los anticuerpos con CDR injertadas constan de mas del 80 % de secuencias de aminoacidos humanas (Queen, C. y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86, 10029; Carter, P. y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89, 4285) . A pesar de estos esfuerzos, se observo que los anticuerpos humanizados con CDR injertadas aun suscitaban una respuesta de anticuerpo contra la region V injertada (Hwang, W. Y., y col. (2005) . Methods, 36, 3) .

Posterior al injerto de CDR, se han desarrollado procedimientos de humanizacion basados en diferentes paradigmas, tales como reaparicion (Padlan, E. A., y col., (1991) . Mol. Immunol., 28, 489) , superhumanizacion (Tan, P., D. A., y col., (2002) J. Immunol., 169, 1119) , optimizacion del contenido de cadenas humanas (Lazar, G. A., y col., (2007) . Mol. Immunol., 44, 1986) y humanizacion mediante modificacion por ingenieria genetica (humaneering) en un intento para disminuir adicionalmente el contenido de secuencias no humanas en mAb terapeuticos (Almagro,

J. C., y col., (2008) . Frontiers in Bioscience 13, 1619) . Al igual que en las estrategias de injerto de CDR, estos procedimientos se basan en analisis de la estructura de anticuerpos y comparacion de secuencias de los mAb no humanos y humanos para evaluar el impacto del proceso de humanizacion en la inmunogenicidad del producto final. Cuando se compara la inmunogenicidad de anticuerpos quimericos y humanizados, la humanizacion de regiones variables parece disminuir adicionalmente la inmunogenicidad (Hwang, W. Y., y col. (2005) . Methods, 36, 3-10) .

Las desinmunizacion es otra estrategia desarrollada para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos quimericos o de raton. Esto implica la identificacion de epitopes de linfocitos T lineales en el anticuerpo de interes, usando bioinformatica, y su reemplazo posterior por mutagenesis dirigida a sitio por secuencias no inmunogenicas o humanas (documento W009852976A1) . Aunque los anticuerpos desinmunizados presentan inmunogenicidad reducida en primates, en comparacion con sus homologos quimericos, se observo alguna perdida de afinidad de union (Jain, M., y col., (2007) . Trends in Biotechnol. 25, 307) .

El desarrollo de la tecnologia de presentacion de fagos complemento y amplio las estrategias de humanizacion en intentos de obtener mAb menos inmunogenicos para terapia en seres humanos. En la presentacion... [Seguir leyendo]

1. Un mamifero murino transgenico que comprende, integrado en su genoma, una molecula de acido nucleico que contiene una region variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada, en el que dicha cadena ligera es capaz de emparejarse con al menos dos cadenas pesadas diferentes codificadas por el mamifero murino, de tal manera que la variedad en la especificidad de anticuerpos esta conservada a traves de reordenamientos e hipermutaciones en las cadenas pesadas, y en el que dicha cadena ligera comprende adicionalmente una region constante de cadena ligera murina.

2. Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 1, que es un raton.

3. Un raton transgenico de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que la integracion es en un locus que es resistente a silenciamiento.

4. Un raton transgenico de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que la integracion es en el locus Rosa.

5. Un mamifero murino transgenico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la molecula de acido nucleico que codifica una cadena ligera esta provista de un medio que permite la expresion de dicha molecula de acido nucleico esencialmente limitada a celulas del linaje de linfocitos B.

6. Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que la molecula de acido nucleico que codifica una cadena ligera esta provista de un medio que permite la expresion de la molecula de acido nucleico que codifica una cadena ligera predominantemente durante una determinada fase del desarrollo de linfocitos B.

7. Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que dicho medio comprende un promotor seleccionado del grupo de CD19, CD20, μHC, VpreB1, VpreB2, VpreB3, λ5, Iga, Igº, κLC, λLC y BSAP (Pax5) .

8. Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 6 o 7, en el que dicho medio comprende un sistema cre-lox.

9. Un raton transgenico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicha cadena ligera es capaz de emparejarse con al menos dos cadenas pesadas murinas.

10. Un mamifero murino transgenico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicha cadena ligera es capaz de emparejarse con al menos dos cadenas pesadas humanas.

11. Un mamifero murino transgenico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que al menos uno de los locus endogenos que codifica una cadena ligera endogena esta silenciado funcionalmente.

12. Un mamifero murino transgenico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el locus de cadena ligera K endogena esta silenciado funcionalmente.

13. Un mamifero murino transgenico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que la secuencia de la molecula de acido nucleico que codifica una cadena ligera es una secuencia VK humana.

14. Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 13, en el que la molecula de acido nucleico que codifica una cadena ligera es una secuencia de la linea germinal.

15. Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 14, en el que la secuencia de la linea germinal esta basada en 012.

16. Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 15, en el que la secuencia de la linea germinal es IGKV1-39*01 / IGKJ1*01.

17. Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la molecula de acido nucleico que codifica una cadena ligera comprende en direccio.

5. 3': un promotor vκ, un lider humano, un gen V humano y una region constante (K) de rata.

18. Un mamifero murino transgenico al cual se ha provisto de un casete de expresion que comprende en direccio.

5. 3': un promotor VK, un lider, un gen V humano reordenado capaz de emparejarse con al menos dos cadenas pesadas diferentes codificados por el mamifero murino, y una region constante (κ) de rata.

19. Un procedimiento de produccion de un anticuerpo deseado que comprende la exposicion de un mamifero murino de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 a un antigeno de tal manera que se induce una respuesta de anticuerpo y el aislamiento de los anticuerpos especificos del antigeno.

20. Un procedimiento de produccion de un anticuerpo deseado que comprende la exposicion de un mamifero murino de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 a un antigeno, de tal manera que se induce una

respuesta de anticuerpo y el aislamiento de celulas que producen dichos anticuerpos, el cultivo y la recuperacion de dichos anticuerpos.

21. Un procedimiento de produccion de un anticuerpo deseado que comprende la exposicion de un mamifero murino de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 a un antigeno de tal manera que se induce una respuesta de anticuerpo y el aislamiento de una molecula de acido nucleico que codifica al menos una parte de dicho anticuerpo, la insercion de dicha molecula de acido nucleico o una copia o un derivado de la misma, en un casete de expresion y la expresion de dicho anticuerpo en una celula huesped.

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