Lipasas con alta especificidad hacia ácidos grasos de cadena corta y usos de las mismas.

Un polinucleótido aislado que codifica una enzima lipolítica, que comprende:

(a) la secuencia nucleotídica como se establece en la SEC ID NO: 1; o

(b) una secuencia nucleotídica que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia nucleotídica de la SEC ID NO: 1 y en la que la enzima lipolítica codificada por la secuencia nucleotídica tiene una mayor especificidad hacia la liberación de ácidos grasos libres que contienen C4 a C10 a partir de una composición láctea que comprende grasa de leche y/u otra grasa si se compara con la liberación de ácidos grasos libres que contienen C12 a C18; o

(c) una secuencia nucleotídica que se hibrida con un polinucleótido que es el complemento de la SEC ID NO: 1 y en la que dicha secuencia nucleotídica es al menos 90% de identidad con la secuencia nucleotídica de la SEC ID NO: 1 y en la que la enzima lipolítica codificada por la secuencia nucleotídica tiene una mayor especificidad hacia la liberación de ácidos grasos libres que contienen C4 a C10 a partir de una composición láctea que comprende grasa de leche y/u otra grasa si se compara con la liberación de ácidos grasos libres que contienen C12 a C18; o

(d) una secuencia nucleotídica que codifica los aminoácidos 34 a 304 en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2; o

(e) una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con los aminoácidos 34 a 304 en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 que tiene una mayor especificidad hacia la liberación de ácidos grasos libres que contienen C4 a C10 a partir de una composición láctea que comprende grasa de leche y/u otra grasa si se compara con la liberación de ácidos grasos libres que contienen C12 a C18; o

(f) una secuencia que es degenerada como resultado de la degeneración del código genético para una secuencia como se define en uno cualquiera de (a) a (e) y en la que la enzima lipolítica codificada por la secuencia nucleotídica tiene una mayor especificidad hacia la liberación de ácidos grasos libres que contienen C4 a C10 a partir de una composición láctea que comprende grasa de leche y/u otra grasa si se compara con la liberación de ácidos grasos libres que contienen C12 a C18.

Lipasas con alta especificidad hacia ácidos grasos de cadena corta y usos de las mismas Campo de la Invención La invención se refiere a secuencias nucleotídicas recientemente identificadas que comprenden genes que codifican una enzima lipolítica novedosa. La invención caracteriza la secuencia codificante de longitud completa del gen novedoso así como también la secuencia de aminoácidos de la proteína funcional de longitud completa y de los equivalentes funcionales del gen, o la secuencia de aminoácidos. La invención también se refiere a métodos que utilizan estas proteínas en procesos industriales, por ejemplo en la industria de alimentos, tal como la industria de lácteos. También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótido de acuerdo con la invención, adecuado para producir estas proteínas y células.

Antecedentes de la Invención Las lipasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de los enlaces éster en sustratos lipídicos, que conducen a la liberación de ácidos grasos. Las lipasas se utilizan en las aplicaciones lácteas para generar sabor, de manera más importante en queso. Tradicionalmente, las preparaciones de lipasa de rumiantes se utilizan derivadas de cabra, cabritas, becerros u ovejas. Estas se derivan de tejidos pregástricos de estos rumiantes, y estas preparaciones de lipasa también se denominan como esterasas pregástricas. Las preparaciones comerciales están en el mercado, tales como Piccantase® C, L, KG y K (DSM Food Specialties, Países Bajos) . Estas lipasas se utilizan en la preparación de una variedad de queso italiano, español, griego y francés. El desarrollo de un perfil de sabor específico en estos tipos de queso durante la maduración se debe mayormente a la acción de las lipasas sobre la grasa de la leche. Las lipasas catalizan la hidrólisis de la grasa de la leche con la generación de ácidos grasos libres. Dichos ácidos grasos pueden tener cadenas cortas (ácidos grasos C4-C6, tales como los que contienen 4 o 6 átomos de carbono, es decir, ácido butírico, caproico) y una cadena media a larga (ácidos grasos C12-C18) . Posteriormente los ácidos grasos libres pueden tomar parte en reacciones químicas, por ejemplo, la formación de compuestos de sabor tal como acetoacetato, beta-cetoácidos, metilcetonas, ésteres y lactonas. La conversión de ácidos grasos en componentes de sabor se puede catalizar por las enzimas que se originan de la población microbiana en el queso.

Se conoce que el tipo de ácidos grasos libres liberados por las lipasas en el queso se puede influenciar por el tipo de las lipasas utilizadas. Por ejemplo, las lipasas que liberan principalmente ácidos grasos de cadena corta (por ejemplo, ácidos grasos que contienen C4 y C6) conducen al desarrollo de un sabor picante, agudo, a especias, fuerte, aunque la liberación de los ácidos grasos de cadena media a larga puede conducir a un sabor jabonoso. Las lipasas encuentran uso creciente en otras aplicaciones lácteas diferentes del queso, tal como el Queso modificado con Enzima (EMC; Wilkinson et al. en Encyclopédia of Dair y Sciences, (2003; Fox et al. eds, Academic Press) p. 434-438) o la hidrólisis de la grasa de mantequilla y nata y sus aplicaciones (Kilara en Enzyclopedia of Dair y Sciences, (2003; Fox et al. eds, Academic Press) p. 914-918) .

Las lipasas de rumiante se prefieren sobre las lipasas microbianas en razón de su especificidad para liberar ácidos grasos de cadena corta (ácidos grasos que contienen C4, C6) de la grasa de la leche. Estos compuestos son ya sea compuestos de sabor en si mismos o se convierten en ésteres volátiles con un impacto de sabor particular ( (Liu et al., Int. Dair y J. 2004, 14, 923-945) . Un tema interesante es la composición de lipasas de rumiante, que es el tema de varios documentos (por ejemplo, Addis et al Int. dair y J. (2005) 15, 1271-1278; Richardson et al, J. Dair y Sci. (1967) 50, 1061- 1065; Addid et al Int. Dair y J. (2005) 15, 563-569; Hamosh Nutrition (1990) 6, 421-428; Calvo et al (2004) J. Dair y Sci. 87, 1132-1142) . Los datos presentados conducen a la conclusión de que la mayoría de las enzimas de rumiante probablemente son mezclas de 2 o más lipasas, y que las variaciones en la composición ocurren conduciendo a cambios en el comportamiento en la formación de sabor del queso. Esta variación es un conductor para la industria para buscar fuentes de enzimas alternativas con consistencia mejorada. La aparición de enfermedades animales como la tembladera de las ovejas y la enfermedad de las vacas locas es otro conductor para la industria para buscar alternativas. El soporte adicional viene del deseo de tener fácil acceso a los productos de calidad Kosher y Halal. Existe por lo tanto un fuerte deseo industrial por alternativas para lipasas derivadas de animal. La solicitud de patente US 2004/0001819 describe la clonación y expresión de una esterasa pregástrica de cabrito en la levadura Píchia pastoris. Aunque potencialmente interesante, la enzima se produce pobremente y además el perfil de liberación del ácido graso libre cambia a ácidos grasos de cadena más larga, comparados con la esterasa de cabrito original. Estos dos aspectos hacen esta enzima poco atractiva en razón de la pobre economía y falta de comportamiento en la aplicación. Una alternativa preferida serían las lipasas microbianas o las lipasas (microbianas) recombinantemente producidas por los microorganismos. Varias lipasas microbianas están en el mercado (véase por ejemplo Bjurlin et al, JAOCS (2001) 78, 153-160) . La característica más importante de las lipasas microbianas para aplicaciones en queso es su perfil de liberación de ácido graso de la grasa de la leche, que deben imitar tan cercanamente como sean posibles las lipasas derivadas de animal. Las lipasas microbianas son, sin embargo, pobres intérpretes a este respecto en razón a que ellas tienen una preferencia por la liberación de ácidos grasos de cadena larga (C12-C18) con relación a los ácidos grasos de cadena corta (C4, C6) . Esto conduce a menudo a la formación de un sabor jabonoso y no al sabor picante deseado. Por lo tanto, a pesar del hecho de que existe un número considerable de preparaciones de lipasa microbiana comerciales en el mercado, subsiste aún la necesidad industrial de una lipasa no derivada de animal que pueda reemplazar las lipasas derivadas de animal tales como las lipasas pregástricas de rumiante.

Se señala que el documento US 2005/059130 describe un método para producir una variante de enzima lipolítica y variantes de enzimas lipolíticas preparadas por el método.

Descripción de las Figuras Figura 1: El perfil FFA generado por las enzimas lipolíticas L01, L03, L04 y por una lipasa microbiana comercial de Rhizomucor miehei (Piccantase® R8000) en pasta del Queso Cheddar comparado con el perfil FFA del queso parmesano.

Objeto de la invención Es el objeto de la presente invención proporcionar enzimas lipolíticas novedosas que sean adecuadas para utilizarse en la industria láctea, más particularmente en la elaboración de queso o de productos similares a queso, en la lipólisis de grasa de mantequilla o nata, o en la producción de queso modificado con enzima. Adicionalmente, es un objeto de la invención proporcionar polinucleótidos novedosos que codifican las enzimas lipolíticas novedosas. Un objeto adicional es proporcionar enzimas lipolíticas recombinantemente producidas así como también cepas recombinantes que producen éstas. También los polipéptidos de fusión son parte de la invención, así como también los métodos de elaboración y utilización de los polinucleótidos y polipéptidos de acuerdo con la invención.

Sumario de la Invención La presente invención proporciona una enzima lipolítica novedosa que es adecuada para utilizarse en la industria láctea. De manera sorprendente, la enzima lipolítica novedosa es extremadamente adecuada para uso en la producción de sabor mediante la modificación enzimática de ingredientes de alimentos que contienen lípido, preferiblemente queso. La enzima lipolítica novedosa se puede utilizar ventajosamente también en la maduración de queso, en la elaboración de productos similares a queso, en la modificación de nata, o de grasa de mantequilla. Adicionalmente, la enzima se puede utilizar adecuadamente también en otras aplicaciones de alimentos, tales como en la elaboración de productos de panadería.

La invención proporciona además polinucleótidos novedosos que codifican las enzimas lipolíticas novedosas.

El polinucleótido que codifica una enzima lipolítica de acuerdo con la invención comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de:

(a) la secuencia nucleotídica como se establece en la SEC ID NO: 1; o

(b) una secuencia nucleotídica que... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido aislado que codifica una enzima lipolítica, que comprende:

(a) la secuencia nucleotídica como se establece en la SEC ID NO: 1; o

(b) una secuencia nucleotídica que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia nucleotídica de la SEC ID NO: 1 y en la que la enzima lipolítica codificada por la secuencia nucleotídica tiene una mayor especificidad hacia la liberación de ácidos grasos libres que contienen C4 a C10 a partir de una composición láctea que comprende grasa de leche y/u otra grasa si se compara con la liberación de ácidos grasos libres que contienen C12 a C18; o

(c) una secuencia nucleotídica que se hibrida con un polinucleótido que es el complemento de la SEC ID NO: 1 y en la que dicha secuencia nucleotídica es al menos 90% de identidad con la secuencia nucleotídica de la SEC ID NO: 1 y en la que la enzima lipolítica codificada por la secuencia nucleotídica tiene una mayor especificidad hacia la liberación de ácidos grasos libres que contienen C4 a C10 a partir de una composición láctea que comprende grasa de leche y/u otra grasa si se compara con la liberación de ácidos grasos libres que contienen C12 a C18; o

(d) una secuencia nucleotídica que codifica los aminoácidos 34 a 304 en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2; o

(e) una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con los aminoácidos 34 a 304 en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 que tiene una mayor especificidad hacia la liberación de ácidos grasos libres que contienen C4 a C10 a partir de una composición láctea que comprende grasa de leche y/u otra grasa si se compara con la liberación de ácidos grasos libres que contienen C12 a C18; o

(f) una secuencia que es degenerada como resultado de la degeneración del código genético para una secuencia como se define en uno cualquiera de (a) a (e) y en la que la enzima lipolítica codificada por la secuencia nucleotídica tiene una mayor especificidad hacia la liberación de ácidos grasos libres que contienen C4 a C10 a partir de una composición láctea que comprende grasa de leche y/u otra grasa si se compara con la liberación de ácidos grasos libres que contienen C12 a C18.

2. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que es el complemento de cualquier secuencia nucleotídica como se expone en la reivindicación 1.

3. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 1, que se produce sintéticamente.

4. Un polinucleótido aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, teniendo dicho polinucleótido una secuencia nucleotídica de acuerdo con la SEC ID NO: 3 o de acuerdo con la SEC ID NO: 5 o de acuerdo con la SEC ID NO: 7.

5. Un polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, que se hibrida bajo condiciones muy restrictivas con una secuencia nucleotídica que es el complemento de la SEC ID NO: 1.

6. Un vector que comprende una secuencia polinucleotídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector según la reivindicación 6, que es un vector de expresión en el que la secuencia polinucleotídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 está operablemente ligada a al menos una secuencia reguladora que permite la expresión de la secuencia polinucleotídica en una célula hospedante adecuada.

8. Un vector según la reivindicación 7, en el que la célula hospedante adecuada es un hongo filamentoso.

9. Una célula hospedante recombinante, que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o que comprende un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

10. Una célula hospedante recombinante según la reivindicación 9, capaz de expresar o sobreexpresar dicho polinucleótido o vector.

11. Un método para fabricar un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que comprende las etapas de cultivar una célula hospedante trasformada con dicho polinucleótido o dicho vector y aislar dicho polinucleótido o dicho vector a partir de dicha célula hospedante.

12. Un polipéptido aislado que tiene actividad lipolítica, que comprende:

(a) una secuencia de aminoácidos que codifica los aminoácidos 34 a 304 en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2; o

(b) una secuencia nucleotídica al menos 90% idéntica a los aminoácidos 34 a 304 en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 2 que tiene una mayor especificidad hacia la liberación de ácidos grasos libres que contienen C4 a C10 a partir de una composición láctea que comprende grasa de leche y/u otra grasa si se compara con la liberación de ácidos grasos libres que contienen C12 a C18.

13. Un polipéptido aislado según la reivindicación 12, en el que dicho polipéptido es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con los aminoácidos 34 a 304 en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 4, o es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con los aminoácidos 34 a 304 en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 6, o es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con los aminoácidos 34 a 304 en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 8.

14. Un polipéptido aislado según la reivindicación 12 ó 13, obtenible expresando un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 5, o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en tanto que se refieran a una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 5, en una célula hospedante apropiada.

15. Un método para fabricar un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, que comprende cultivar una célula hospedante recombinante según la reivindicación 9 ó 10 bajo condiciones que permitan la expresión de un polinucleótido según la reivindicación 1, 3 a 5, o un vector según las reivindicaciones 6 a 8, en tanto que se refieran a una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 5, y opcionalmente recuperar el polipéptido codificado a partir de la célula o el medio de cultivo.

16. Uso de un polipéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en la fabricación de un alimento.

17. Uso según la reivindicación 16, en la fabricación de un producto lácteo, preferiblemente en la fabricación de un queso, un producto similar a queso, queso modificado con enzimas (EMC) o en la fabricación de mezclas de ácidos grasos libres obtenibles mediante la lipólisis de grasa de mantequilla o nata.

18. Un método para preparar un producto lácteo, en el que se añade un polipéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 a una composición láctea utilizada en la producción de un producto lácteo, bajo condiciones suficientes para hacer reaccionar la enzima.

19. El uso según la reivindicación 16, 17 o el método según la reivindicación 18, en el que el polipéptido se utilza en el desarrollo de sabor.

20. El uso o método según la reivindicación 19, en el que las sensaciones agudas, fuertes, picantes son mayores que las sensaciones jabonosas en el perfil de la harina del producto lácteo.

21. El uso según la reivindicación 16, en la fabricación de un producto horneado.

22. Una composición de enzima de hornear que comprende un polipéptido aislado que tiene actividad lipolítica según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, y una o más enzimas adicionales.

23. Una composición según la reivindicación 22, en la que la enzima adicional se selecciona del grupo que consiste en una amilasa, una alfa-amilasa, una beta-amilasa, una amilasa maltogénica o una amilasa no maltogénica, una ciclodextrina glucanotrasferasa, una proteasa, una peptidasa, una exopeptidasa, una transglutaminasa, una lipasa, una galactolipasa, una fosfolipasa, preferiblemente una fosfolipasa A, una celulasa, una hemicelulasa, una xilanasa, una proteasa, una disulfuro isomerasa de proteína, una glucosiltransferasa, una peroxidasa, una lacasa, una oxidasa, una hexosa oxidasa, una glucosa oxidasa, una aldosa oxidasa, una piranosa oxidasa, una lipoxigenasa y una L-aminoácido oxidasa.

24. Una composición de hornear que comprende DATEM y un polipéptido aislado que tiene actividad lipolítica según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.

25. Método para preparar una masa, que comprende las etapas de añadir el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 12-14 o una composición según la reivindicación 22 ó 24 a al menos uno de los ingredientes de la masa.

26. Una masa que comprende el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 12-14 o una composición según la reivindicación 22 ó 24.

27. Una masa según la reivindicación 26, que tiene una estabilidad mejorada de la masa.

28. Una masa según una cualquiera de las reivindicacione.

2. 27, que tiene al menos una de las propiedades mejoradas seleccionadas del grupo que consiste en mayor resistencia, mayor estabilidad, mayor elasticidad, menor pegajosidad, y una extensibilidad mejorada de la masa.

29. Método para preparar un producto horneado, que comprende la etapa de hornear la masa según una cualquiera de las reivindicacione.

2. 28.

30. Método para preparar un producto horneado según la reivindicación 29, en el que el producto horneado tiene al menos una propiedad mejorada seleccionada del grupo que consiste en mayor volumen, mejor sabor, mejor estructura de la miga, mejor suavidad de la miga, mejor tostado, formación reducida de ampollas y mejor antiañejamiento.

31. Método para preparar un producto horneado según la reivindicación 30, en el que el producto horneado es un pan, una torta o un producto horneado preparado a partir de masa laminada.

32. Método para preparar un producto horneado según la reivindicación 31, en el que el producto horneado es una torta libre de emulsionante o una torta con menos huevos.

33. Método para producir una masa de cocinar a partir de la cual puede derivar una torta, en el que se usa una enzima lipolítica según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.

34. Método para preparar una torta, que comprende la etapa de hornear la masa de cocinar según la reivindicación

33.

35. Método para preparar una torta según la reivindicación 34, en el que la torta es una torta en la que se ha reducido la cantidad de huevos y/o grasa.

36. Método para producir una torta según la reivindicación 34 o una masa de cocinar según la reivindicación 33, que comprende las etapas de:

a. preparar una masa de cocinar de una torta añadiendo al menos:

azúcar, harina, fosfolipasa A, la enzima lipolítica según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 y huevos; y opcionalmente b. hornear la masa de cocinar para producir una torta en el que la torta comprende una cantidad reducida de huevos y/o grasa, o en el que no se ha aplicado reducción de huevos y/o grasa de la torta.

37. Una masa de cocinar de torta que comprende una enzima lipolítica según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.

38. El uso de una composición que comprende al menos una fosfolipasa A y una enzima lipolítica según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 para mejorar al menos una de las propiedades seleccionadas del grupo que consisten de: (i) viscosidad de la masa de cocinar, (ii) densidad específica de la masa de cocinar, (iii) suavidad de la miga inicial de la torta, (iv) homogeneidad del poro de la miga de la torta, (v) diámetro del poro de la miga de la torta, (vi) suavidad de la miga con el almacenamiento de la torta, (vii) periodo de caducidad de la torta y/o (viii) volumen de la torta.