Inmunoglobulina glicosilada e inmunoadhesina que la comprende.

Una inmunoglobulina glicosilada o una porción Fc de la misma, en la que una variante de inmunoglobulina, que comprende una o más modificaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en M160N, A195N, T243N, E265N, Y299T, F331T y Q346N está glicosilada adicionalmente mediante modificación de un residuo aminoácido, caracterizada por que:

la variante de inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs 17, 19, 21 y 23.

Inmunoglobulina glicosilada e inmunoadhesina que la comprende

Campo técnico

La presente invención se refiere a una inmunoglobulina glicosilada y a una inmunoadhesina que la comprende. Más particularmente, la presente invención se refiere a una inmunoglobulina o a un fragmento de la misma que está adicionalmente glicosilado por modificación de un residuo aminoácido específico, y a una proteína de fusión glicosilada formada como resultado del enlace de la inmunoglobulina glicosilada o un fragmento de la misma con al menos una proteína biológicamente activa o una porción de la misma.

Técnica de antecedentes Las inmunoadhesinas (o proteínas de fusión de inmunoglobulina) son moléculas similares a anticuerpos que resultan de la fusión de un fragmento (p. ej. porción Fc) de una inmunoglobulina y una región de unión al ligando de un receptor o una molécula adhesiva. Las inmunoadhesinas típicas conocidas en la técnica tienen la estructura de un anticuerpo en el que la región variable que participa en el reconocimiento del antígeno, está reemplazada por una región de unión al ligando de un receptor, al tiempo que conserva la porción Fc. Durante mucho tiempo, un gran número de patentes ha descrito proteínas de fusión en las que una región específica de una proteína fisiológicamente activa está enlazada a un anticuerpo (patentes de EE.UU. Nºs 5.521.288, 5.844.095, 6.046.310, 6.090.914, 6.100.383 y 6.225.448) .

La inmunoadhesina tiene las siguientes ventajas frente a una molécula que no contiene una inmunoglobulina:

1) la proteína de fusión tiene una avidez total incrementada por un ligando, ya que tiene bivalencia en una forma dímera;

2) la proteína de fusión está presente en una forma no destruida en el suero durante un período de tiempo más largo en virtud de una estabilidad molecular incrementada;

3) células efectoras son activadas por la porción Fc (fragmento cristalizable) de la cadena pesada de inmunoglobulina; y

4) la proteína de fusión es aislada y purificada por un método conveniente, por ejemplo utilizando proteína A.

Por ejemplo, en el caso del factor de necrosis tumoral (al que se alude aquí en lo que sigue simplemente como “TNF”) en calidad de una citoquina, para suprimir respuestas de inflamación dependientes de TNF, se puede utilizar un receptor del factor de necrosis tumoral (al que se alude aquí en lo que sigue simplemente como “TNFR”) según se describe en las publicaciones PCT Nºs WO 92/16221 y WO 95/34326, o se puede utilizar una proteína de fusión de TNFR-inmunoglobulina (Ig) según se describe en la patente de EE.UU. Nº 5.447.851 y en la publicación PCT Nº WO 94/06476. De acuerdo con numerosos informes, proteínas de fusión de TNFR-Ig tienen una afinidad mucho mayor al TNF que la forma monómera nativa o una forma no fusionada a Ig de TNFR (Lesslauer W. Et al. Eur. J. Immunol., 1991, vol. 21, pág. 2883; Ashkenazi A. et al. PNAS USA, 1991, vol. 88, pág. 10535; Peppel K. et al. J. Exp. Med., 1991, vol. 174, pág. 1483; Mohler K. M. et al. J. Immunol., 1993, vol. 151, pág. 1548) .

Con respecto a la inhibición de la acción de TNF o al control de las respuestas inmunes utilizando una proteína de fusión de Ig, se espera que una forma multivalente o multimerizada del dominio extracelular, como un dominio funcional de receptores de TNF, CD2 y CTLA4 en una construcción de fusión de Ig, mejore la eficacia de la construcción de fusión. Cuando una proteína de fusión monomérica (proteína de fusión de cadena pesada) del dominio extracelular del receptor de TNF y la cadena pesada de Ig se expresa en una línea de células simultáneamente con otra proteína de fusión monomérica (proteína de fusión de cadena ligera) del dominio extracelular del receptor de TNF y la cadena ligera de Ig, se produce una proteína de fusión dimérica mediante la interacción entre la cadena pesada y la cadena ligera. La proteína de fusión dimérica tiene dos dominios eficaces dispuestos en paralelo tal como en la forma in vivo, y tiene una eficacia acusadamente incrementada en comparación con construcciones de fusión monoméricas (Scallon B.J. et al. Cytokine, 1995, vol. 7, pág. 759) .

Sin embargo, una proteína de fusión de Ig de este tipo en una forma dimérica es difícil de industrializar debido a los siguientes problemas: deberían co-introducirse en una célula hospedadora dos genes que estén individualmente fusionados a las cadenas pesada y ligera de Ig; cuando dos proteínas de fusión diferentes son expresadas simultáneamente en una sola célula, sus rendimientos disminuyen grandemente; y debido a que todas las proteínas de fusión de cadena pesada y las proteínas de fusión de cadena ligera expresadas no participan en la formación de dímeros, dímeros que fusionan una proteína de fusión de cadena pesada y una proteína de fusión de cadena ligera son técnicamente difíciles de aislar a partir de una mezcla con las proteínas de fusión de cadena pesada monoméricas o las proteínas de fusión de cadena ligera.

A este respecto, los autores de la presente invención construyeron una proteína concatamérica, en la cual un extremo C del dominio soluble de una proteína biológicamente activa está enlazado a un extremo N del dominio soluble de una proteína biológicamente activa, idéntica o diferente, utilizando tecnología de ADN recombinante. También, los autores de la presente invención prepararon una construcción de ADN que codifica una proteína dimérica, en la que dos moléculas de una proteína monomérica en la que un concatámero de una proteína que participa en una respuesta inmune está enlazado a la región de bisagra de un fragmento Fc de inmunoglobulina, están unidas por disulfuro en la región de bisagra y producían una proteína de fusión dimérica enlazada al concatámero utilizando tecnología de ADN recombinante basada en la construcción de ADN.

Tal como se describe antes, se han realizado intentos para mejorar la eficacia y el método de preparación de proteínas de fusión de inmunoglobulina, pero casi todos los esfuerzos han sido incapaces de aumentar la estabilidad de las proteínas de fusión de inmunoglobulina. A este respecto, según se describe en el documento KR 2004 0009997 A1, los autores de la presente invención desarrollaron un método para aumentar la estabilidad de proteínas añadiendo un motivo de glicosilación a una región de conjunción entre un dominio funcional de una proteína y una región Fc de inmunoglobulina. Sin embargo, cuando una inmunoadhesina es glicosilada próxima a un dominio funcional, la proteína no se pliega correctamente o tiene una función reducida.

T. Shantha Raju discute en el Artículo Glycosylation Variations with Expression Systems (Bio Process International, abril de 2003, pág. 46 y siguientes) la glicosilación de IgG humana. Uno de los tópicos son los cambios debido a variaciones en las condiciones de las células. La maquinaria de glicosilación de líneas de células derivadas de ovarios de hámster chino y de ratón se compara con la maquinaria de glicosilación humana. Sólo se observan ligeras diferencias que no afectan a la calidad del producto.

El documento WO 03/010202 A1 describe una proteína de fusión de CTLA4-Ig que consiste en un péptido señal, el dominio extracelular soluble CTLA4 y la región Fc de IgG1, una proteína de fusión CTLA4-CTLA4-Ig Fc concatamérica y una proteína de fusión CTLA4-CTLA4-Ig Fc glicosilada concatamérica. La proteína de fusión CTLA4-CTLA4-Ig Fc glicosilada concatamérica contiene tres sitios de N-glicosilación insertados entre los dos dominios de CTLA4. Esta forma muestra la concentración más elevada en sangre.

Descripción de la invención A este respecto, los autores de la presente invención construyeron una proteína de fusión glicosilada introduciendo un motivo de glicosilación adicional en una inmunoglobulina, particularmente una porción Fc de una proteína de fusión de inmunoglobulina, y encontraron que la proteína de fusión glicosilada actúa in vivo durante un período de tiempo más prolongado que la forma que no contiene un motivo de glicosilación, conduciendo con ello a la presente invención.

Así, en un aspecto, la presente invención de acuerdo con la reivindicación 1 proporciona una inmunoglobulina glicosilada o una porción Fc de la misma, en la que está adicionalmente glicosilada una variante de inmunoglobulina que comprende una o más modificaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en M160N, A195N, T243N, E265N, Y299T, F331T y Q346N.

En otro aspecto, la presente invención de acuerdo con la reivindicación 2 proporciona un ADN que codifica una inmunoglobulina glicosilada o una porción Fc... [Seguir leyendo]

1. Una inmunoglobulina glicosilada o una porción Fc de la misma, en la que una variante de inmunoglobulina, que comprende una o más modificaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en M160N, A195N, T243N, E265N, Y299T, F331T y Q346N está glicosilada adicionalmente mediante modificación de un residuo aminoácido, caracterizada por que:

la variante de inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs 17, 19, 21 y 23.

2. Un ADN que codifica una inmunoglobulina glicosilada o una porción Fc de la misma, en la que una variante de inmunoglobulina que comprende una o más modificaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en M160N, A195N, T243N, E265N, Y299T, F331T y Q346N está glicosilada adicionalmente mediante modificación de un residuo aminoácido, caracterizada por que:

la variante de inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs 17, 19, 21 y 23.

3. Una proteína de fusión glicosilada, formada como resultado del enlace de (a) una inmunoglobulina glicosilada o una porción Fc de la misma, en la que una variante de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos modificada formando una o más secuencias Asn-X-Ser/Thr, X es cualquier residuo aminoácido, excluida prolina, está adicionalmente glicosilada por modificación de un residuo aminoácido, con (b) al menos una proteína biológicamente activa o una porción de la misma, en donde la variante de inmunoglobulina, que comprende una o más modificaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en M160N, A195N, T243N, E265N, Y299T, F331T y Q346N, está glicosilada adicionalmente mediante modificación de un residuo aminoácido, caracterizada por que:

la variante de inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs 17, 19, 21 y 23.

4. La proteína de fusión glicosilada de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizada por que la porción de la proteína biológicamente activa es un dominio extracelular soluble.

5. La proteína de fusión glicosilada de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en donde la proteína biológicamente activa se selecciona del grupo que consiste en hemoglobina, proteínas del suero, citoquinas, interferones α, β y γ, factores estimulantes de colonias, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , proteínas activantes de fosfolipasa, insulina, proteínas vegetales, factor de necrosis tumoral (TNF) y sus alelos mutantes, factores de crecimiento, hormonas, calcitonina, péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) , encefalina sintética, somatomedina, eritropoyetina, factores de liberación del hipotálamo, prolactina, gonadotropina crónica, agentes activantes de plasminógeno tisular, péptido liberador de hormona del crecimiento (GHRP) , factor humoral tímico (THF) , interleuquinas, interferones y enzimas.

6. Una proteína de fusión glicosilada en forma dimérica, en que dos moléculas de la proteína de fusión glicosilada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 están enlazadas por un enlace disulfuro en una región de bisagra.

7. Un ADN que codifica la proteína de fusión glicosilada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.

8. Un vector de expresión recombinante que comprende el ADN que codifica la proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7.

9. El vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, que tiene el número de acceso KCCM10572, depositado en el Centro de Cultivo de Microorganismos de Corea bajo las provisiones del Tratado de Budapest.

10. Una célula hospedadora transformada o transfectada con el vector de expresión recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 8 ó 9.

11. Un método para preparar una proteína de fusión glicosilada, que comprende: cultivar la célula hospedadora transformada o transfectada de acuerdo con la reivindicación 10 y aislar la proteína de fusión glicosilada a partir del cultivo resultante.

12. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión glicosilada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.