Procedimiento para inhibir la expresión génica.
Un procedimiento in vitro para inhibir la expresión de un gen objetivo en una célula,
que comprende introducir enla célula un polinucleótido bicatenario que comprende una quimera de ADN y ARN con una secuencia depolinucleótidos sustancialmente idéntica a al menos una secuencia parcial de nucleótidos del gen objetivo, en elque el polinucleótido bicatenario consiste en 19 - 25 nucleótidos y al menos la mitad de la región delpolinucleótido bicatenario desde el extremo 3' de la hebra antisentido es ARN.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2002/012183.
Solicitante: ASTELLAS PHARMA INC..
Nacionalidad solicitante: Japón.
Dirección: 3-11, NIHONBASHI-HONCHO 2-CHOME, CHUO-KU TOKYO 103-8411 JAPON.
Inventor/es: TEI,KUMIKO, KAJI,TAKAHIDE, UEDA,RYU, SAIGO,KAORU.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K31/713 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Acidos nucleicos u oligonucleótidos con estructura en doble hélice.
- C07H21/00 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos.
- C12N15/113 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Acidos nucleicos no codificantes que modulan la expresión de genes, p.ej. oligonucleótidos antisentido.
- G01N33/50 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
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Fragmento de la descripción:
Procedimiento para inhibir la expresión génica.
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a un procedimiento para inhibir la expresión de un gen objetivo mediante latransfección de un polinucleótido bicatenario que comprende ADN y ARN, con una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a al menos una secuencia parcial de nucleótidos del gen objetivo, en una célula.
ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA
Los procedimientos para inhibir la expresión de un gen objetivo en una célula, tejido u organismo individual incluyenun procedimiento (en lo sucesivo, denominado a menudo como "procedimiento del ARNi") en el que un ARNbicatenario es transfectado en la célula, tejido u organismo individual para acelerar así la degradación del ARNm quetiene homología con su secuencia, y como resultado, inhibir la expresión de un gen que es el molde del ARNm (en losucesivo, este efecto se denomina a menudo como "efecto del ARNi") . Hasta la fecha se ha informado de que estatécnica es eficaz en individuos vegetales (Waterhouse, P. M., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 95, 13959 -13964 (1998) ) , tripanosomas (Ngo, H. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 95, 14687 - 14692 (1998) ) , hidras (Lohmann J.U., y col., Dev. Biol., 214, 211 - 214 (1999) ) , planarias (Sánchez Alvarado, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 96, 5049 - 5054 (1999) ) , nematodos (Fire, A., y col., Nature, 391, 806 - 811 (1998) , Drosophila (Rannerdell, J. R., y col., Cell, 95, 1017 - 1026 (1998) ; Misquitta, X., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 96, 1451 - 1456 (1999) ) .
Además, aunque se ha informado de que el efecto es limitado en vertebrados, se ha informado de que el uso de unARN bicatenario teniendo cada uno 19 nucleótidos unidos por salientes de 2 nucleótidos en 3' permite la exhibicióndel efecto del ARNi en células cultivadas de vertebrados (Elbashir, S., y col., Nature, 411, 494 - 498 (2001) ) . En laidentificación de la función génica descrita a continuación, y el procedimiento de cribado de líneas celulares adecuadas para la producción de sustancias útiles, la superioridad del uso del procedimiento del ARNi es apreciable, pero existen problemas ya que el ARN es extremadamente fácilmente degradado por una ribonucleasa, especialmente en estado monocatenario, y porque el coste de la producción es elevado. Por lo tanto, se ha deseadodesarrollar un polinucleótido altamente estable que pueda usarse en el procedimiento del ARNi.
DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN
Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para inhibir la expresión de un gen objetivo conuna secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a una secuencia de nucleótidos parcial de un polinucleótido, mediante la introducción en la célula de un polinucleótido bicatenario con una estabilidad mejorada gracias a laincorporación de ADN.
Como resultado de amplios estudios para conseguir el objeto anterior, los presentes inventores han averiguado que, en una célula cultivada de hámster, CHO-KI, la transfección con un polinucleótido bicatenario de un híbrido de ARNy ARN con una parte de la secuencia de bases de un gen de luciferasa, y con un polinucleótido bicatenario de una quimera de ADN y ARN, se inhibe la expresión del gen de la luciferasa en la célula. Por lo tanto, hemos conseguidola presente invención.
A saber, según la presente invención, se proporcionan las invenciones descritas en los siguientes (1) a (8) .
(1) Un procedimiento para inhibir la expresión de un gen objetivo en una célula que comprende la introducción en lacélula de un polinucleótido bicatenario que comprende una quimera de ADN y ARN con una secuencia depolinucleótidos sustancialmente idéntica a al menos una secuencia de nucleótidos parcial del gen objetivo, en el queel polinucleótido bicatenario consiste en 19 -25 nucleótidos, y al menos la mitad de la región del polinucleótidobicatenario desde el extremo 3' de la hebra antisentido es ARN.
(2) El procedimiento según (1) anterior, en el que el polinucleótido bicatenario comprende una hebra simple autocomplementaria.
(3) Un procedimiento in vitro para inhibir la expresión de dos o más genes objetivo en una célula, que comprende
introducir dos o más polinucleótidos bicatenarios que comprenden una quimera de ADN y ARN con una secuenciade polinucleótidos sustancialmente idéntica a al menos una secuencia de nucleótidos parcial del gen objetivo en lacélula,
en el que los polinucleótidos bicatenarios consisten en de 19 a 25 nucleótidos, y al menos la mitad de la región delpolinucleótido bicatenario desde el extremo 3' de la hebra antisentido es ARN.
(4) Un procedimiento para analizar la función de un gen, que comprende analizar un cambio fenotípico que apareceen la célula o en el tejido como resultado de la inhibición de la expresión de un gen objetivo mediante el procedimiento según uno cualquiera de los puntos 1 a 3.
(5) Un procedimiento para impartir una propiedad específica a una célula, que comprende inhibir la expresión de ungen objetivo en la célula usando el procedimiento según uno cualquiera de los puntos 1 a 3.
(6) Un procedimiento para preparar un polinucleótido bicatenario que inhibe la expresión de un gen objetivo en una célula, en el que
el polinucleótido bicatenario comprende una quimera de ADN y ARN con una secuencia de polinucleótidos sustancialmente idéntica a al menos una secuencia de nucleótidos parcial del gen objetivo, y
el polinucleótido bicatenario consiste en de 19 a 25 nucleótidos, y al menos la mitad de la región del polinucleótidobicatenario desde el extremo 3' de la hebra antisentido es ARN.
(7) Una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido bicatenario que comprende una quimera deADN y ARN con una secuencia de polinucleótidos sustancialmente idéntica a al menos una secuencia parcial denucleótidos del gen objetivo,
en el que el polinucleótido bicatenario consiste en de 19 a 25 nucleótidos, y al menos la mitad de la región delpolinucleótido bicatenario desde el extremo 3' de la hebra antisentido es ARN.
(8) Una composición para su uso como un medicamento, que comprende un polinucleótido bicatenario que comprende una quimera de ADN y ARN con una secuencia de polinucleótidos sustancialmente idéntica a al menosuna secuencia parcial de nucleótidos del gen objetivo,
en el que el polinucleótido bicatenario consiste en de 19 a 25 nucleótidos, y al menos la mitad de la región delpolinucleótido bicatenario desde el extremo 3' de la hebra antisentido es ARN.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 es un dibujo que ilustra las secuencias de los polinucleótidos monocatenarios sentido consistentes en 21nucleótidos y los polinucleótidos monocatenarios antisentido consistentes en 21 nucleótidos que se usaron para lapreparación de los polinucleótidos bicatenarios. En cada secuencia, la izquierda significa 5' terminal y la derechasignifica 3' terminal, y se muestra que la parte con caracteres en negrita es ARN y la parte subrayada es ADN.
La Fig. 2 es un dibujo que ilustra la inhibición de la expresión de un gen luc en el caso de que las células CHO-KIsean transfectadas con los polinucleótidos bicatenarios del híbrido de ADN-ARN.
La Fig. 3 es un dibujo que ilustra la inhibición de la expresión de un gen luc en el caso de que las células S2 seantransfectadas con los polinucleótidos bicatenarios en los que cada hebra sentido es ARN y cada hebra antisentido esla quimera de ADN-ARN.
La Fig. 4 es un dibujo que ilustra la inhibición de la expresión de un gen luc en el caso de que las células HeLa y HEK293 sean transfectadas con los polinucleótidos bicatenarios en los que cada hebra sentido es ARN y cada hebraantisentido es la quimera de ADN-ARN.
La Fig. 5 es un dibujo que ilustra la inhibición de la expresión de un gen luc en el caso de que las células CHO-K1sean transfectadas con los polinucleótidos bicatenarios que son la quimera de ADN-ARN.
MEJOR MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN
A continuación se describirá la presente invención con más detalle.
(1) Polinucleótido bicatenario que comprende ADN y ARN para su uso en el procedimiento del ARNi La presente invención es un procedimiento para inhibir la expresión de un gen objetivo en una célula que comprendeintroducir en la célula un polinucleótido bicatenario que comprende una quimera de ADN y ARN con una secuenciade polinucleótidos sustancialmente idéntica a al menos una secuencia parcial de nucleótidos de un gen objetivo, enel que el polinucleótido bicatenario consiste en de 19 a 25 nucleótidos, y al menos la mitad de la región... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento in vitro para inhibir la expresión de un gen objetivo en una célula, que comprende introducir enla célula un polinucleótido bicatenario que comprende una quimera de ADN y ARN con una secuencia depolinucleótidos sustancialmente idéntica a al menos una secuencia parcial de nucleótidos del gen objetivo, en elque el polinucleótido bicatenario consiste e.
19. 25 nucleótidos y al menos la mitad de la región del polinucleótido bicatenario desde el extremo 3' de la hebra antisentido es ARN.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido bicatenario comprende una hebra simpleautocomplementaria.
3. Un procedimiento in vitro para inhibir la expresión de dos o más genes objetivo en una célula, que comprende
introducir dos o más polinucleótidos bicatenarios que comprenden una quimera de ADN y ARN con una secuencia de polinucleótidos sustancialmente idéntica a al menos una secuencia parcial de nucleótidos del genobjetivo en la célula,
en el que los polinucleótidos bicatenarios consisten en de 19 a 25 nucleótidos y al menos la mitad de la región delos polinucleótidos bicatenarios desde el extremo 3' de la hebra antisentido es ARN.
4. Un procedimiento de análisis de la función de un gen, que comprende analizar un cambio fenotípico que apareceen la célula o en el tejido como resultado de la inhibición de la expresión de un gen objetivo mediante por elprocedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Un procedimiento para impartir una propiedad específica a una célula, que comprende la inhibición de la expresión de un gen objetivo en la célula usando el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 3.
6. Un procedimiento para preparar un polinucleótido bicatenario que inhibe la expresión de un gen objetivo en unacélula, en el que
el polinucleótido bicatenario que comprende una quimera de ADN y ARN con una secuencia de polinucleótidossustancialmente idéntica a al menos una secuencia parcial de nucleótidos del gen objetivo, y
el polinucleótido bicatenario consiste en de 19 a 25 nucleótidos y al menos la mitad de la región de lospolinucleótidos bicatenarios desde el extremo 3' de la hebra antisentido es ARN.
7. Una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido bicatenario que comprende una quimera deADN y ARN con una secuencia de polinucleótidos sustancialmente idéntica a al menos una secuencia parcial denucleótidos del gen objetivo,
en el que el polinucleótido bicatenario consiste e.
19. 25 nucleótidos y al menos la mitad de la región delpolinucleótido bicatenario desde el extremo 3' de la hebra antisentido es ARN.
8. Una composición para su uso como un medicamento, que comprende un polinucleótido bicatenario quecomprende una quimera de ADN y ARN con una secuencia de polinucleótidos sustancialmente idéntica a almenos una secuencia parcial de nucleótidos del gen objetivo,
en el que el polinucleótido bicatenario consiste e.
19. 25 nucleótidos y al menos la mitad de la región de lospolinucleótidos bicatenarios desde el extremo 3' de la hebra antisentido es ARN.
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