Inhibidores de peptidilarginina desiminasa (PAD).

Compuesto capaz de inhibir la actividad de una PAD que comprende una parte peptídica y un grupo electrofílicoreactivo al tiol portado por un aminoácido Ω

donde

(a) la parte peptídica comprende al menos 5 aminoácidos y no más de 20 aminoácidos,

(b) el péptido comprende el motivo (b2):

(b2) H/K/F/L/W - S/D/H -Ω- D/E - H/Y/F/W donde Ω representa un aminoácido que porta un grupoelectrofílico reactivo al tiol

(c) opcionalmente el N-término y/o C-término de la secuencia peptídica se modifican y

(d) donde el grupo electrofílico reactivo al tiol es un grupo halógeno-amidina, preferiblemente una fluoroamidinao una cloroamidina.

Inhibidores de peptidilarginina desiminasa (PAD)

Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere al campo de la medicina, en particular a la prevención y el tratamiento de enfermedades autoinmunes y más específicamente a la artritis reumatoide (RA) . La presente invención también se refiere al campo de la enzimología. La invención se refiere a un método para desarrollar inhibidores enzimáticos y divulga potentes inhibidores de la enzima peptidil arginina desiminasa (EC 3.5.3.15) . Estos inhibidores de PAD se pueden utilizar para preparar medicamentos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, en particular para el tratamiento de RA, psoriasis y esclerosis múltiple (MS) .

Antecedentes de la invención [0002] La RA es una enfermedad común autoinmune predominante en aproximadamente el 1% de la población mundial. Es de origen multifactorial y está caracterizada por la inflamación de la membrana sinovial de las articulaciones, causando hinchazón de las articulaciones y dolor. El proceso inflamatorio frecuentemente conduce a la destrucción del cartílago y a la erosión irreversible del hueso.

Los autoanticuerpos anti-CCP desempeñan una función importante en la aparición y la perpetuación de la RA. Primero, se ha demostrado que los anticuerpos anti-CCP son altamente específicos para la RA. Los resultados de diferentes estudios muestran que los individuos que son seropositivos para estos anticuerpos bien ya tienen RA bien desarrollarán esta enfermedad en el futuro. La presencia de anticuerpos anti-CCP (especialmente cuando hay títulos altos) es un factor predictivo de evolución de la enfermedad erosiva {Nijenhuis et al.., 2004}. Por último, se ha demostrado que los anticuerpos anti-CCP se producen localmente en el sitio de la inflamación. La proporción de anticuerpos anti-CCP con respecto al IgG total encontrado en el material sinovial de pacientes con RA pareció ser significativamente superior al del suero de los mismos pacientes {Masson-Bessière et al., 2000, Reparon-Schuijt et al., 2001}. La presencia de células de plasma que producen anti-CCP en la membrana sinovial es indicativa de una maduración dirigida por antígeno de células B específicas de CCP en el sitio de la inflamación. La defensa de la función de los anticuerpos anti-CCP en la generación de la artritis viene de estudios en ratones knockout FcyR11B. Se demostró que las inmunoglobulinas de plasma o suero de pacientes con RA activa inducían la inflamación y las lesiones histológicas en estos ratones {Petkova et al., 2006}. En un modelo de artritis inducida por colágeno, se informó de que los anticuerpos contra las proteínas citrulinadas mejoraron los daños en los tejidos, fundamentando la función directa de estos anticuerpos en la patogénesis de la artritis autoinmune {Kuhn et al., 2006}. En un documento reciente, Hill y colaboradores informaron de que el fibrinógeno citrulinado es capaz de inducir artritis, caracterizada por hiperplasia sinovial seguida de anquilosis, en ratones transgénicos DR4-IE. El barrido de epítopos de células T y el análisis de micromatriz de anticuerpos identificaron un único modelo de reactividad específica de citrulina que se encontró en los ratones transgénicos DR4-IE inmunizados con fibrinógeno inmodificado o en ratones C57BL/6 tipo salvaje inmunizados con fibrinógeno citrulinado. Estas observaciones implican directamente al fibrinógeno citrulinado como artritogénico en el contexto de las moléculas de clase II MHC asociadas a la RA {Hill et al., 2008}.

De acuerdo con este mecanismo dirigido por antígeno, se ha demostrado la presencia de proteínas citrulinadas en la sinovial inflamada de la RA. Se ha informado de que las formas citrulinadas de las cadenas a y º de fibrina no sólo se producen en la sinovial de pacientes con RA {Masson-Bessière et al., 2001}. La caracterización molecular del antígeno Sa identificó Sa como vimentina citrulinada. Se ha informado de que antígeno Sa, al que se dirigen específicamente los anticuerpos de RA, está presente en la membrana sinovial inflamada. El influjo de calcio en los macrófagos derivados de monocitos, que están abundantemente presentes en la membrana sinovial inflamada, conduce a la citrulinación de la vimentina, y el hecho de que la vimentina se pueda segregar por macrófagos en respuesta a vías de señalización proinflamatorias es acorde con una función de la vimentina citrulinada en el desarrollo de RA {Vossenaar y camioneta Venrooij, 2004}. Además de la fibrina y la vimentina, se pueden producir otros autoantígenos citrulinados en una articulación inflamada. Usando un método proteómico se identificaron 13 proteínas autoantigénicas citrulinadas, incluyendo fibrinógenas, en el tejido sinovial de un paciente con RA {Matsuo et al., 2006}. Se ha informado de que la enzima PAD4 de citrulinación (véase más adelante) se activa en granulocitos moribundos, y esto conduce a la citrulinación de proteínas nucleares {Nakashima et al.., 2002}. Es posible que en los granulocitos apoptóticos de la membrana sinovial inflamada no se eliminen debidamente, un fenómeno previamente observado en los pacientes con lupus eritematoso sistémico {Ren et al., 2003}, y como resultado las proteínas citrulinadas pueden quedar expuestas al sistema inmunológico.

La citrulinación es la conversión postraduccional de residuos de arginina en residuos de citrulina, que se cataliza por peptidil arginina desiminasa (PAD) . Las enzimas peptidil arginina desiminasa (PAD; EC 3.5.3.15) catalizan la conversión de residuos de arginina en residuos de citrulina en las proteínas. No existe ningún ARNt para la citrulina, la presencia de residuos de citrulina en las proteínas es el resultado exclusivamente de la modificación postraduccional. En mamíferos (seres humanos, ratones y ratas) se han identificado cinco isotipos de PAD (PAD1 -PAD6; 'PAD4' y 'PAD5' se usan para el mismo isotipo) , cada uno codificado por un gen diferente {Vossenaar et al., 2003b}. Todas estas enzimas se basan fuertemente en la presencia de Ca2+ para actividad y son incapaces de convertir L-arginina libre en Lcitrulina libre. La L-arginina libre se puede convertir en L-citrulina libre por sintasa de óxido nítrico (EC 1.14.13.39) en eucariotas o por arginina desiminasa (EC 3.5.3.6) en bacterias. Estas enzimas no son dependientes de Ca2+.

La diferencia más pronunciada entre las enzimas PAD altamente homólogas es su expresión tisular específica. En la epidermis, PAD1 (sinónimos: PAD I, PAD tipo I) está relacionada con la citrulinación de los filamentos de queratina durante las fases finales de la diferenciación de queratinocito, que es importante para la reorganización del revestimiento cornificado. Otro sitio de citrulinación en la epidermis es el folículo capilar, que contiene PAD3 (sinónimos PAD III, PAD tipo III) y su sustrato natural tricohialina (THH) . THH es una proteína estructural importante de las células de la vaina de la raíz y de la capa de médula del folículo capilar y, en menor medida, de otros epitelios especializados. El isotipo PAD identificado más recientemente, PAD6 (sinónimo: ePAD) , se encontró en láminas citoplásmicas de ovocitos de ratón, que tienen una función importante en la embriogénesis temprana. La expresión de su ortólogo humano resultó estar restringida a leucocitos de ovarios, de testículos y de sangre periférica {Chavanas et al.., 2004}. Originalmente, este isotipo PAD se designó ePAD, pero según la numeración sistemática de otras PAD, este isotipo se redenominó PAD6 {Vossenaar et al.., 2003b}. El isotipo más ampliamente expresado, PAD2 (sinónimos: PAD II, PAD tipo II, PAD-H19) , está presente en tejidos muy diferentes, tales como músculo esquelético, cerebro, bazo, glándulas secretoras y macrófagos. A pesar de este amplio modelo de expresión, sólo la proteína básica de la mielina (MBP) y la vimentina se han identificado como sustratos naturales. Los pacientes con MS desarrollan una respuesta autoinmune contra la MBP. La MBP es una proteína abundante de la vaina de mielina, y su citrulinación ocurre durante el desarrollo del sistema nervioso central. Se observó citrulinación de vimentina durante la apoptosis inducida por ionóforo de calcio de los macrófagos de humano y de ratón y, como se ha descrito anteriormente, se mostró que la vimentina citrulinada es el objetivo de los autoanticuerpos anti-Sa específicos de la RA. A diferencia de las PADs mencionadas anteriormente, que se localizan todas principalmente en el citoplasma de las células, el isotipo PAD4 (sinónimos: PAD IV, PAD tipo IV, PAD HL-60, PAD V, PAD tipo V, PADI4) se localiza en el núcleo. La señal de localización nuclear de PAD4 fue encontrada en la región N-terminal de la proteína. PAD4 se expresa principalmente en los granulocitos y... [Seguir leyendo]

1. Compuesto capaz de inhibir la actividad de una PAD que comprende una parte peptídica y un grupo electrofílico reactivo al tiol portado por un aminoácido 0 donde

(a) la parte peptídica comprende al menos 5 aminoácidos y no más de 20 aminoácidos,

(b) el péptido comprende el motivo (b2) : (b2) H/K/F/L/W - S/D/H -0- D/E - H/Y/F/W donde 0 representa un aminoácido que porta un grupo electrofílico reactivo al tiol

(c) opcionalmente el N-término y/o C-término de la secuencia peptídica se modifican y

(d) donde el grupo electrofílico reactivo al tiol es un grupo halógeno-amidina, preferiblemente una fluoroamidina

o una cloroamidina.

2. Compuesto según la reivindicación 1, donde 0 es ornitina.

3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde el motivo definido en (b2) es: H / K/F/L/W-D-0-D-H/Y/F/W.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la secuencia peptídica comprende o consiste en 7 aminoácidos.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el N-término de la secuencia peptídica se modifica por un grupo acetilo y/o el C-término como una amida.

6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el N-término de la secuencia peptídica se modifica por adición de un grupo 2-naftilsulfonilo y/u opcionalmente donde el C-término se modifica por adición de un Daminoácido.

7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la secuencia peptídica comprende o consiste en SEQ ID NO.

2. 78, 82, 84, 85 donde R se ha sustituido por 0.

8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el compuesto comprende o consiste en SEQ ID NO.

10. 125, 129-141, preferiblemente 120, 122, 129-141, más preferiblement.

13. 141, incluso más preferiblemente 138, 141.

9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la parte peptídica comprende o consiste en las secuencias SEQ ID NO.

12. 135.

10. Composición que comprende un compuesto tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y al menos un excipiente, preferiblemente donde la composición es conveniente para la administración local, preferiblemente la inyección en una articulación o la administración transdérmica tópica.

11. Composición según la reivindicación 10 que comprende además un inmunodepresivo y/o un agente supresor de inflamación.

12. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, para su uso como un medicamento, preferiblemente donde el medicamento es para la prevención, retraso y/o tratamiento de un trastorno autoinmunológico, preferiblemente donde el trastorno autoinmunológico es RA.

13. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, para la producción de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de un trastorno autoinmunológico, preferiblemente donde el trastorno autoinmunológico es RA.