Huellas de microARN durante megacariocipoyesis humana.

Un método para diagnosticar leucemia megacarioblástica aguda (LMA) en un sujeto,

que comprende:

i) determinar el nivel de al menos un producto génico de miR en una muestra del sujeto; y

ii) comparar el nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra con un control, en donde el control esel nivel del al menos un producto génico de miR de un sujeto que no tiene LMA, y en el que un aumento en elnivel del al menos un producto génico de miR en la muestra del sujeto, en relación con el del control, esdiagnóstico de LMA y

en el que el al menos un producto génico de miR es miR-135.

Huellas de microARN durante megacariocipoyesis humana

Antecedentes de la invención Los microARN (miARN) son una familia no codificante pequeña de ARN de 19-25 nucleótidos que regulan la expresión génica dirigiéndose al ARN mensajero (ARNm) de una manera específica de secuencia, induciendo la represión de la traducción o degradación a ARNm dependiendo del grado de complementariedad entre los miARN y sus dianas (Bartel, D. P. (2004) Cell 116, 281-297; Ambros, V. (2004) Nature 431, 350-355) . Se conservan muchos miARN en secuencia entre organismos lejanamente relacionados, lo que sugiere que estas moléculas participan en procesos esenciales. De hecho, los miARN están implicados en la regulación de la expresión génica durante el desarrollo (Xu, P., et al. (2003) Curr. Biol. 13, 790-795) , proliferación celular (Xu, P., et al. (2003) Curr. Biol. 13, 790795) , apoptosis (Cheng, A. M., et al. (2005) Nucl. Acids Res. 33, 1290-1297) , metabolismo de glucosa (Poy, M. N., et 15 al. (2004) Nature 432, 226-230) , resistencia a la tensión (Dresios, J., et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1865-1870) y cáncer (Calin, G. A, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 1554-15529; Calin, G. A., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 11755-11760; He, L., et al. (2005) Nature 435, 828-833; y Lu, J., et al. (2005) Nature 435: 834-838) .

Hay pruebas sólidas de que los miARN desempeñan un papel en la hematopoyesis de mamíferos. En ratones, se expresan diferencialmente miR-181, miR-223 y miR-142 en tejidos hematopoyéticos, y su expresión está regulada durante la hematopoyesis y el compromiso de linaje (Chen, C. Z., et al. (2004) Science 303, 83-86) . La expresión ectópica de miR-181 en células progenitoras hematopoyéticas murinas condujeron a la proliferación en el compartimento de linfocitos B (Chen, C. Z., et al. (2004) Science 303, 83-86) . La realización de perfiles génicos de 25 miARN sistemáticos en células del sistema hematopoyético murino reveló diferentes patrones de expresión de miARN en el sistema hematopoyético en comparación con tejidos neuronales, e identificaron cambios de expresión de miARN individuales que se producen durante la diferenciación celular (Monticelli, S., et al. (2005) Genome Biology 6, R71) . Un estudio reciente ha identificado la modulación negativa de miR-221 y miR-222 en cultivo eritropoyéticos humanos de células progenitoras de sangre del codón umbilical CD34’ (Felli, N., et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 18081-18086) . Se descubrió que estos miARN se dirigían al oncogén c-Kit. Estudios funcionales adicionales indicaron que la reducción de estos dos miARN en cultivos eritropoyéticos desbloquea la producción de proteína Kit en el nivel de traducción lo que conduce a la expansión de células eritroides tempranas (Fell, N., et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 18081-18086) . En línea con la hipótesis de que los miARN regulan la diferenciación celular, se descubrió que miR-223 era un miembro clave de un circuito regulador que implicaba C/EBPa y NFI-A, que controla la diferenciación granulocítica en líneas celulares leucémicas promielocíticas agudas tratadas con ácido transretinoico (Fazi, F., et al. (2005) Cell 123, 819-831) .

También se han encontrado miARN desregulados en tumores malignos hematopoyéticos. De hecho, el primer informe que ligaba los miARN y el cáncer implicaba la deleción y regulación negativa del grupo miR-15a y miR-16-1, localizado en el cromosoma 13q14.3, una región habitualmente suprimida en leucemia linfocítica crónica (Calin, G. A, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 1554-15529) . También se indicó alta expresión de miR-155 y el gen hospedador BIC en linfomas de linfocitos B (Metzler M., et al. (2004) Genes Chromosomes and Cancer 39; 167169) . Más recientemente, se ha mostrado que el grupo miR-17-92, que se localiza en una región genómica de amplificación en linfomas, esta sobreexpresado en linfomas de linfocitos B humanos y la expresión forzada de este 45 grupo actuó conjuntamente con la expresión de c-MYC para acelerar el desarrollo tumoral en un modelo de linfoma de linfocitos B de ratón (He, L., et al. (2005) Nature 435, 828-833) . El documento WO2005/118806 describe métodos y composiciones para generar perfiles de miARN y emplear dichos perfiles en la terapia, diagnóstico y pronóstico de una serie de cánceres tales como leucemia mielógena aguda. Estas observaciones indican que los miARN son importantes reguladores de la hematopoyesis y pueden estar implicados en la transformación en tumores malignos.

Las plaquetas desempeñan un papel esencial en la hemostasis y trombosis. Se producen en grandes números a partir de sus células parentales, megacariocitos de médula ósea, y surgen de fragmentación del citoplasma. Solo recientemente se ha empezado a definir la base molecular de lo que puede convertirse en una gran familia de trastornos relacionados que afectan a la producción de plaquetas. Si el nivel de plaquetas en circulación desciende 55 por debajo de un cierto número (trombocitopenia) , el paciente corre el riesgo de hemorragia catastrófica. Los pacientes con cáncer que han recibido quimioterapia o transplantes de médula ósea habitualmente tienen trombocitopenia, y la lenta recuperación del recuento de plaquetas en estos pacientes ha sido preocupante. La demanda de unidades de plaquetas para transfusión ha aumentado progresivamente principalmente debido a la necesidad de mantener un cierto nivel de plaquetas en dichos pacientes con cáncer o los que se someten a cirugía cardiaca importante.

La huella de microARN que se expresa diferencialmente en células cancerosas (por ejemplo, células de leucemia) puede ayudar a determinar miARN específicos que están implicados en el cáncer y otros trastornos (por ejemplo, trastornos plaquetarios) . Además, la huella de dianas potenciales de esos miARN puede ayudar a desvela su papel 65 patogénico. En particular, el descubrimiento de los patrones y secuencia de expresión de miARN durante la diferenciación hematopoyética puede proporcionar información acerca de los papeles funcionales de estos genes no codificantes pequeños en hematopoyesis normal y maligna.

Existe la necesidad de nuevos métodos y composiciones para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de cáncer, trastorno mieloproliferativos y trastornos plaquetarios (por ejemplo, trastornos plaquetarios heredados) . 5

Sumario de la invención La presente invención se basa, en parte, en la identificación de miARN específicos que están implicados en la diferenciación megacariocítica y/o tienen niveles de expresión alterados en células cancerosas (por ejemplo, en leucemia megacarioblástica aguda (líneas celulares de LMA) ) . En el presente estudio, se ha investigado la expresión génica de miARN en cultivos de megacariocitos humanos de progenitores CD34+ de médula ósea y líneas celulares de leucemia megacarioblástica aguda. Los resultados de este análisis indican que varios miARN están regulados negativamente durante la diferenciación megacariocítica normal. Los resultados demuestran además que estos miARN se dirigen a genes implicados en megacariocitopoyesis, mientras que otros están sobreexpresados en células cancerosas.

En consecuencia, la invención abarca métodos para diagnosticar LMA en un sujeto (por ejemplo, un ser humano) . De acuerdo con los métodos de la invención, el nivel de al menos un producto génico de miR en una muestra de ensayo del sujeto se compara con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en un control, en el que el al menos un producto génico de miR es miR-135, y en el que el control es el nivel del al menos un producto génico de miR de un sujeto que no tiene LMA. Un aumento en el nivel del producto génico de miR en la muestra de ensayo, en relación con el nivel del producto génico de miR correspondiente en la muestra de control, es diagnóstico de LMA. En una realización, el método comprende además determinar el nivel de un producto génico de miR adicional seleccionado del grupo que consiste en miR-101, miR-126, miR-106 y miR-20. Se desvelan en el presente documento métodos adicionales. En los métodos desvelados en el presente documento, el cáncer que se diagnostica o pronostica puede ser una leucemia (por ejemplo, leucemia mieloide aguda (por ejemplo, leucemia megacarioblástica aguda) ) o mieloma múltiple. Como alternativa, el trastorno mieloproliferativo puede seleccionarse del grupo que consiste en trombocitemia esencial (TE) , policitemia vera (PV) , mielodisplasia, mielofibrosis (por ejemplo, metaplasia mieloide agnogénica (MMA) (también denominada mielofibrosis idiopática) ) y leucemia mielógena crónica (LMC) .

También se desvela un método para tratar un cáncer... [Seguir leyendo]

1. Un método para diagnosticar leucemia megacarioblástica aguda (LMA) en un sujeto, que comprende:

i) determinar el nivel de al menos un producto génico de miR en una muestra del sujeto; y ii) comparar el nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra con un control, en donde el control es el nivel del al menos un producto génico de miR de un sujeto que no tiene LMA, y en el que un aumento en el nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra del sujeto, en relación con el del control, es diagnóstico de LMA y

en el que el al menos un producto génico de miR es miR-135.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además determinar en nivel de un producto génico de miR

adicional seleccionado del grupo que consiste en miR-101, miR-126, miR-106 y miR-20. 15

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que el sujeto es un ser humano.

4. El método de la reivindicación 1, 2 o 3, en el que el producto génico de miR-135 comprende miR-135a que tiene

SEC ID Nº: 389. 20

5. El método de la reivindicación 1, 2 o 3, en el que el producto génico de miR-135 comprende miR-135b que tiene SEC ID Nº: 390.

en líneas celulares de LMA