Homólogos de factor de crecimiento de fibroblastos.

Una molécula polinucleótida aislada que codifica un polipéptido homólogo al factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se muestra en la SEQ ID NO:

1 desde el nucleótido 82 hasta el nucleótido 621.

Homólogos de factor de crecimiento de fibroblastos.

Antecedentes de la invención La familia de factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) consiste en al menos nueve miembros distintos (Basilico et al., Adv. Cancer Res. 59:115-165, 1992 y Fernig et al., Prog. Growth Factor Res. 5 (4) :353-377, 1994) que actúan generalmente como mitógenos para un amplio espectro de tipos de células. Por ejemplo, el FGF básico (conocido también como FGF-2) es mitogénico in vitro para células endoteliales, células musculares lisas vasculares, fibroblastos y, generalmente, para células de origen mesodérmico o neuroectodérmico, incluyendo miocitos cardiacos y esqueléticos (Gospodarowicz et al., J. Cell. Biol. 70:395-405, 1976; Gospodarowicz et al, J. Cell. Biol. 89:558-578, 1981 y Kardami, J. Mol. Cell. Biochem. 92:124-134, 1990) . In vivo, se ha demostrado que el bFGF desempeña un papel en el desarrollo cardiaco aviar (Sugi et al., Dev. Biol. 168:567-574, 1.995 y Mima et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:467-471, 1995) , y que induce el desarrollo coronario colateral en perros (Lazarous et al., Circulation, 94:1074-1082, 1996) . Además, se han demostrado actividades no mitogénicas para diversos miembros de la familia FGF. Las actividades no proliferativas asociadas con FGF ácido y/o básico incluyen: aumento de liberación endotelial de activador tisular del plasminógeno, estimulación de síntesis de matriz extracelular, quimiotaxis de células endoteliales, expresión inducida de genes contráctiles fetales en cardiomiocitos (Parker et al, J. Clin., Invest. 85:507-514, 1990) , y una mayor capacidad de respuesta hormonal pituitaria (Baird et al., J. Cellular Physiol. 5:101-106, 1987) .

Varios miembros de la familia FGF no tienen una secuencia señal (aFGF, bFGF y posiblemente FGF-9) y, de esta manera, no se espera que sean secretadas. Además, varios de los miembros de la familia FGF tienen la capacidad de migrar al núcleo celular (Friesel et al., FASEB 9:919-925, 1995) . Todos los miembros de la familia FGF se unen a heparina basándose en similitudes estructurales. La homología estructural cruza especies, lo que sugiere una conservación de su relación estructura/función (Ornitz et al., J. Biol. Chem. 271 (25) :15292-15297, 1996)

Hay cuatro receptores FGF extracelulares conocidos (FGFRs) , y todos son tirosina quinasas. En general, los miembros de la familia FGF se unen a todos los FGFR conocidos, sin embargo, FGF específicos se unen a receptores específicos con mayor grado de afinidad. Otro medio para la especificidad dentro de la familia FGF es la expresión espacial y temporal de los ligandos y sus receptores durante la embriogénesis. La evidencia sugiere que, muy probablemente, los FGF actúan sólo de una manera autocrina y/o paracrina, debido a su afinidad de unión a heparina, lo que limita su difusión desde el sitio de liberación (Flaumenhaft et al., J. Cell. Biol. 111 (4) :1651-1659, 1990) El FGF básico carece de una secuencia señal y, por lo tanto, está limitada a los modos de de acción paracrina o autocrina. Se ha postulado que el FGF básico se almacena intracelularmente y se libera tras un daño tisular. Se ha demostrado que el FGF básico tiene dos regiones de unión a receptor que son distintas del sitio de unión a heparina (Abraham et al., EMBO J. 5 (10) : 2523-2528, 1986) .

Se ha demostrado que el FGFR-3 desempeña un papel en el crecimiento óseo. Ratones convertidos en homocigóticos con receptor nulo para el FGFR-3 (-/-) dieron como resultado anomalías esqueléticas posnatales (Colvin et al, Nature Genet. 12:309-397, 1996 y Deng et al, Cell 84:911-921, 1995) . El fenotipo mutante sugiere que en ratones normales, el FGFR-3 desempeña un papel en la regulación de la división de células condrocito en la región de la placa de crecimiento del hueso (Goldíarb, Cytokine Growth Factor Rev. 7 (4) :311-325, 1996) . El ligando para el FGFR-3 en la placa de crecimiento de hueso no ha sido identificado.

Aunque se han identificado cuatro FGFRs, todos los cuales han demostrado tener variantes alternativas de corte y empalme funcionales, la posibilidad de que existan nuevos receptores de FGF es bastante probable. Por ejemplo, no se ha identificado un receptor para la isoforma FGF-8a (MacArthur et al., J. Virol. 69 (4) : 2501-2507, 1995) .

El FGF-8 es un miembro de la familia FGF que se aisló originalmente a partir de células de carcinoma mamario como un mitógeno inducible por andrógenos. Ha sido mapeado al cromosoma humano 10q25-q26 (White et al., Genómica 30:109-11, 1995) . El FGF-8 está implicado en el desarrollo embrionario de las extremidades (Vogel et al, Development

122: 1737-1750, 1996 y Tanaka et al, Current Biology 5 (6) : 594-597, 1995) . La expresión de FGF-8 durante la embriogénesis en tejido cardiaco, genitourinario y neural indica que puede desempeñar un papel en el desarrollo de estos tejidos (Crossley et al., Development 121:439-451, 1995) . Hay algunas evidencias de que la acrocefalosindactilia, una afección congénita caracterizada por la cabeza puntiaguda y dedos palmeados, está asociada con mutaciones puntuales de FGF-8 (White et al., 1995, ibid) .

El FGF-8 tiene cinco exones, a diferencia de otros FGF conocidos, que sólo tienen tres exones. Los primeros tres exones del FGF-8 corresponden al primer exón de los otros FGFs (MacArthur et al., Development 121:3603-3613, 1995) . El gen humano para el FGF-8 codifica para cuatro isoformas que difieren en sus regiones N-terminales: isoformas a, b, e, y f del FGF; en contraste con el gen murino que da lugar a ocho isoformas de FGF-8 (Crossley et al., 1995, ibid) . El FGF-8a y el 8b-FGF humanos tienen un 100 % de homología con las proteínas murinas, y las proteínas FGF-8e y FGF-8f tienen una homología del 98 % entre humanos y ratones (Gemel et al., Genómica 35:253-257, 1996) .

La enfermedad cardiaca es la principal causa de muerte en los Estados Unidos, representando hasta el 30 % de todas las muertes. El infarto de miocardio (IM) representa 750.000 hospitalizaciones por año en los EE.UU., con más de 5 millones de personas diagnosticadas con enfermedad coronaria. Los factores de riesgo de IM son la diabetes mellitus, la hipertensión, la obesidad troncular, el tabaquismo, los niveles altos de lipoproteína de baja densidad en plasma o la predisposición genética.

La hiperplasia cardiaca es un aumento en la proliferación de miocitos cardiacos, y se ha demostrado que se produce con el envejecimiento normal en el ser humano y en ratas (Olivetti et al., J. Am. Coll. Cardiol. 24 (1) :140-9, 1994 y Anversa et al., Circ. Res. 67:871-885, 1990) , y en la cardiomiopatía inducida por catecolamina en ratas (Deisher et al., Am. J. Cardiovasc. Pathol. 5 (1) :79-88, 1994) . Si el aumento en los miocitos se origina con algún progenitor, o si es resultado de la proliferación de un tipo de célula más diferenciada terminalmente, sigue siendo controvertido.

Sin embargo, debido a que el infarto y otras causas de necrosis miocárdica parecen ser irreparables, parece que los mecanismos normales de hiperplasia cardiaca no pueden compensar una muerte miocítica extensa y sigue existiendo una necesidad de factores exógenos que promuevan la hiperplasia y, en última instancia, resulten en la renovación de la capacidad del corazón para funcionar.

La remodelación ósea es el proceso dinámico mediante el cual se mantienen la masa tisular y la arquitectura esquelética. El proceso es un equilibrio entre resorción ósea y formación ósea, en el que se cree que dos tipos de células son los principales actores. Estas células son el osteoblasto y el osteoclasto. Los osteoblastos sintetizan y depositan una matriz que se convierte en hueso nuevo. Las actividades de los osteoblastos y los osteoclastos son reguladas por muchos factores, sistémicos y locales, incluyendo factores de crecimiento.

Aunque la interacción entre los factores locales y sistémicos no se ha aclarado por completo, no parece haber consenso en que los factores de crecimiento desempeñan un papel clave en la regulación tanto de la remodelación normal del esqueleto como en la reparación de fracturas. Algunos de los factores de crecimiento que se han identificado en el hueso incluyen: IGF-I, IGF-II, TGF-β1, TGF-β2, bFGF, aFGF, PDGF y la familia de proteínas óseas morfogénicas (Baylink et al., J. Bone Mineral Res. 8 (supp. 2) : S56S-5572, 1993) .

Cuando la resorción ósea excede la formación ósea, resulta una pérdida ósea neta, y se aumenta la propensión a fracturas. Una menor formación ósea está asociada con el envejecimiento y ciertos estados patológicos. Sólo en los EE.UU., hay aproximadamente 1, 5 millones de fracturas al año que se atribuyen a la osteoporosis. El impacto de estas fracturas sobre la calidad de vida del... [Seguir leyendo]

1. Una molécula polinucleótida aislada que codifica un polipéptido homólogo al factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1 desde el nucleótido 82 hasta el nucleótido 621;

2. Una molécula polinucleótida aislada que codifica un polipéptido homólogo al factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 6 desde el nucleótido 82 hasta el nucleótido 621;

3. Una molécula polinucleótida aislada que codifica un polipéptido homólogo al factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 desde el residuo de aminoácido 28 hasta el residuo 196;

4. Una molécula polinucleótida aislada que codifica un polipéptido homólogo al factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 desde el residuo de aminoácido 28 hasta el residuo 207;

5. Molécula polinucleótida aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el polinucleótido es ADN.

6. Un vector de expresión que comprende los siguientes elementos unidos operativamente: un promotor de transcripción; un segmento de ADN según la reivindicación 5; y un terminador de transcripción,

7. El vector de expresión según la reivindicación 6, en el que el segmento de ADN es SEQ ID NO: 1 desde el nucleótido 82 al nucleótido 621; o en el que el segmento de ADN es SQ ID NO: 6 desde el nucleótido 82 al nucleótido 621.

8. El vector de expresión según la reivindicación 6, en el que el segmento de ADN es una secuencia que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 desde el residuo de aminoácido 28 al residuo 196; o en el que el segmento de ADN es una secuencia que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 desde el residuo de aminoácido 28 al residuo 207.

9. Célula cultivada en la que se ha introducido un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que dicha célula expresa un polipéptido codificado por el segmento de ADN.

10. Procedimiento de producción de un polipéptido homólogo al FGF, que comprende:

cultivar una célula en la que se ha introducido un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 68, en donde dicha célula expresa un polipéptido homólogo al FGF codificado por el segmento de ADN; y recuperar el polipéptido homólogo al FGF.

11. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2 desde el residuo 28 hasta el residuo 196.

12. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2 desde el residuo 28 hasta el 207.

13. Polipéptido aislado según las reivindicaciones 11 ó 12, que comprende además una secuencia de señal secretora.

14. Polipéptido aislado según la reivindicación 13, en el que la secuencia de señal secretora comprende los residuos de aminoácidos 1-27 de la SEQ ID NO: 2.

15. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que el polipéptido comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2, desde el residuo 28 al residuo 196; o

(ii) una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2, desde el residuo 28 al residuo 207.

16. Una molécula polinucleótida aislada según la reivindicación 3 ó 4, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido con un residuo inicial Met.

17. Un polipéptido aislado según las reivindicaciones 11 ó 12, que comprende además un residuo inicial Met.

18. Vector de expresión según la reivindicación 8, en el que el segmento de ADN codifica un polipéptido con un residuo inicial Met.