Procedimiento de generación de anticuerpos de dominio VL individual en animales transgénicos.

Un anticuerpo de dominio VL individual quimérico que comprende un segmento de dominio VL humano,

un segmento de dominio DH humano, un segmento de dominio JL humano, una región C de cadena pesada no humana, en el que la región C de cadena pesada no humana comprende una bisagra, un CH2 y un segmento de dominio CH3 y está sustancial o completamente desprovista de un segmento de dominio CH1.

Procedimiento de generación de anticuerpos de dominio VL individual en animales transgénicos

Referencia cruzada a la solicitud relacionada La presente solicitud reivindica prioridad de las Solicitud Provisional de Patente de EE.UU. N.º 61/055.725, presentada el 23 de mayo de 2008.

Antecedentes

Campo técnico De manera general, la presente invención se refiere a anticuerpos de dominio variable individual que tienen un dominio variable de cadena ligera (VL) y más específicamente a anticuerpos de dominio VL individuales que comprenden un dominio VL humano, procedimientos de preparación, procedimientos de uso y a células no humanas transgénicas y animales que producen dichos anticuerpos.

Descripción de la técnica relacionada Las inmunoglobulinas convencionales contienen cuatro cadenas de polipéptidos; dos polipéptidos de cadena pesada idénticos (H) y dos polipéptidos de cadena ligera idénticos (L) . Las cadenas L son bien K o bien A. Las terminaciones amino de cada cadena pesada y ligera contienen una región variable (VH y VL, respectivamente) y la región constante (C) está en la terminación carboxi. La región constante de cadena pesada (CH) contiene el dominio CH1, la región de bisagra y dominios CH2, CH3 y opcionalmente CH4. Los dominios CH2 y CH3 componen la región Fc de la cadena pesada. La región constante de cadena ligera más corta (CL) forma una asociación unida a disulfuro con el dominio CH1 de la cadena pesada. Las dos cadenas pesadas están unidas por medio de uno o más enlaces de disulfuro en la región de bisagra. Juntos y solos, los dominios CH1 y CL pueden influenciar la estabilidad cis de VH y VL pareados. La región FC actúa en trans para influenciar la resistencia de las actividades del sistema inmunológico por medio de unión a receptores Fc y para proporcionar una semivida larga en circulación. La cadena pesada del anticuerpo también media la superficie celular y los componentes críticos de señalización a través del desarrollo de células B y la maduración por medio de la membrana y las secuencias de señalización intracelulares que se pueden empalmar alternativamente sobre CH3 o CH4. El anticuerpo se muestra sobre la superficie de la célula B en el contexto del receptor de la célula B, que contiene otros miembros importantes de modulación de señal tales como lga e lg1.

Además de los anticuerpos convencionales, los camélidos (por ejemplo, camellos, alpacas y llamas) y determinados peces cartilaginosos (por ejemplo, tiburones nodriza y tapicero) producen de forma natural anticuerpos de solo cadenas pesadas desprovistos de cadenas ligeras (véase la Figura 1) . Los anticuerpos de solo cadenas pesadas son homodímeros de cadena pesada formados por dominios de VH y CH y son distintivos de los anticuerpos convencionales anteriormente mencionados de heterotetrámeros de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. Un grupo de segmentos génicos VHH de camélidos, en lugar de segmentos génicos VH convencionales, dominan el repertorio de la región V usada en los anticuerpos de solo cadenas pesadas (revisado en De Genst y col. Dev. Comp. Immunol. 30: 187-198) . Los genes VHH de camélidos tienen contrastes bien caracterizados que pueden compensar la cara hidrófoba expuesta de la región variable que, de lo contrario, se emparejaría con la región VL. Estos contrastes incluyen mutaciones de aminoácidos específicos y en ocasiones, una región CDR3 más larga que puede "cubrir" partes de la cara hidrófoba.

Los anticuerpos de solo cadena individual tal como los anticuerpos de solo cadenas pesadas de camélidos pueden tener utilidad terapéutica. Su tamaño pequeño frente a los anticuerpos convencionales convierte su producción en más sencilla y menos costosa y puede permitir una penetración más eficaz en los tejidos de la enfermedad tales como tumores sólidos. Además, se pueden aislar los dominios V y se pueden combinar usando técnicas de biología molecular para preparar nuevos formatos tales como moléculas bi-, tri- y cuadri-específicas que podrían presentar utilidad terapéutica mejorada en comparación con los anticuerpos mono-específicos. Los dominios VH aislados a partir de los anticuerpos convencionales requieren el apareamiento VL y por tanto, son difíciles de expresar, pueden ser insolubles y pueden adolecer de pérdida de enlace al antígeno diana. De este modo, se desea una fuente fiable y rentable de diversos repertorios de anticuerpos de dominio V individual con unión de alta afinidad y buena solubilidad para el descubrimiento y desarrollo de fármacos terapéuticos.

La observación reciente sugiere que se pueden producir espontáneamente anticuerpos de solo cadenas pesadas, aunque ineficazmente, sin adquirir mutaciones de tipo VHH específicas en ratones deficientes de cadena ligera. Estos anticuerpos carecen de dominio CH1 debido a episodios raros de empalme aberrante desde el exón J hasta el exón CH1 (Zou y col. , J. Exp. Med. 204: 3271-3283) . Las células de ratón pueden expresar, mostrar en superficie y segregar anticuerpos de VHH de camélidos (Nguyen y col., Immunol. 109: 93-101; Zou y col., J. Immunol. 175: 3769-3779) . Los ratones se han sometido a modificación genética con transgenes que portan genes VHH de camélido unidos operacionalmente a DH humano, JH y genes de región específica eliminados del dominio CH1 y mutantes por separado para el locus IgH de ratón endógeno funcional (mutante !MT) (Janssens y col. Proc. Nat.

Acad. Sci. 103: 15130-15135) . Los ratones transgénicos reordenan el VHH de camélido a segmentos génicos DH-JH reordenados y expresan los anticuerpos de cadena pesada individual de DJ-C de VHH humano de camélidos quiméricos. No obstante, el uso de la región V de los anticuerpos de solo cadena H a partir de dichos ratones con fines terapéuticos requeriría la humanización de la mayoría de la región V, debido a su origen de secuencia de camélido. Además, no está claro el modo en el que estos transgenes soportan la reconstitución de los compartimientos de células B en desarrollo, el compartimiento de células B maduras y un repertorio inmunológico diferente primario y secundario.

Se han construido ratones transgénicos en un intento de someter a ensayo técnico una plataforma para la generación de anticuerpos humanos de solo cadenas pesadas. Estas construcciones transgénicas tienen genes VH, DH, JH y C! y/o Co humanos o de camélido que se eliminan del exón CH1 en un antecedente genético con un locus IgH endógeno no funcional (mutación !MT) . Algunas de las construcciones de transgenes salvaron el desarrollo de las células B, bloquearon la reorganización del locus IgL y poblaron el compartimiento linfoide secundario (Solicitud de Patente Internacional de N.ºs de Publicación WO 2004/0497794, WO 2006/008548 y WO 2007/096779) . No obstante, el análisis más detallado de los compartimientos de las células B y los procedimientos de diversificación de secuencias sugirieron la necesidad de mejora para una utilización satisfactoria como plataforma para la generación de anticuerpos humanos de solo cadenas pesadas. Recientemente, se han creado transgenes de mayor tamaño con más contenido de VH humano (véase la Solicitud de Patente Internacional Nº. WO 2008/035216) . Algunos de los genes VH incluidos presentaron mutaciones específicas basadas en modelos moleculares diseñadas para aumentar la solubilidad de un dominio VH no apareado con un dominio VL (véase Rothlisberger y col., J. Mol. Biol. (2005) 347: 773-789 y las referencias citadas en la misma) . Todavía no está claro si las citadas mutaciones pueden compensar la insolubilidad de las regiones de VH aisladas.

La solicitud de patente de EE.UU. US 2006/280734 se refiere a un procedimiento para la generación de moléculas de inmunoglobulina de especificidad predeterminada. En particular, se describe un procedimiento para la re-dirigir la especificidad de unión a epítopo de uno o más anticuerpos usando dominios variables individuales que exhiben especificidad de unión a epítopo.

Un problema crítico a solucionar cuando se someten ratones a modificación para la expresión de anticuerpos de solo cadenas pesadas y el posterior uso para la generación de anticuerpos de solo cadenas pesadas de calidad terapéutica es un requisito para el despliegue satisfactorio y la señalización de receptores de células B (BCR) por parte de células B a través del desarrollo y las respuestas inmunológicas primaria y secundaria con el fin de generar un repertorio diverso de anticuerpos de alta afinidad. El BCR y su precursor pre-BCR comprenden cadenas de inmunoglobulinas, IgH, IgL y cadenas ligeras de sustituto. Se puede secretar el anticuerpo satisfactoriamente a la superficie celular, deber ser estable y soluble, su región variable debe encajar... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo de dominio VL individual quimérico que comprende un segmento de dominio VL humano, un segmento de dominio DH humano, un segmento de dominio JL humano, una región C de cadena pesada no humana, en el que la región C de cadena pesada no humana comprende una bisagra, un CH2 y un segmento de dominio CH3 y está sustancial o completamente desprovista de un segmento de dominio CH1.

2. El anticuerpo de dominio VL individual quimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde

(1) el segmento de dominio VL humano es un segmento de dominio VK o un segmento de dominio VA;

(2) los segmentos de dominio CH2 y CH3 no humanos son segmentos de dominio Cy; o

(3) el segmento de dominio JL humano es un segmento de dominio JK o un segmento de dominio JA.

3. El anticuerpo de dominio VL individual quimérico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde

(1) dicho anticuerpo de dominio VL individual comprende un homodímero; o

(2) dicho anticuerpo de dominio VL individual comprende un heterodímero.

4. Un polinucleótido que comprende segmentos génicos VL, DH y JL humanos unidos operativamente a una bisagra de región C de cadena pesada no humana y segmentos génicos CH2 y CH3, en donde dicho polinucleótido codifica un anticuerpo de dominio VL individual quimérico de acuerdo con la reivindicación 1.

5. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4, en donde

(1) el segmento génico VL humano es un segmento génico VK o un segmento génico VA;

(2) los segmentos génicos CH2 y CH3 no humanos son segmentos génicos C! y el polinucleótido además comprende opcionalmente segmentos génicos Cy o segmentos génicos Co;

(3) los segmentos génicos CH2 y CH3 no humanos no son segmentos génicos C!;

(4) el segmento génico JL humano es un segmento génico JK o un segmento génico JA;

(5) el polinucleótido además comprende un elemento regulador cis no humano;

(6) el polinucleótido además comprende una región de cambio no humana, en la que opcionalmente dicha región de cambio no humana es S!;

(7) el polinucleótido comprende además un LCR 3´ no humano; o

(8) el polinucleótido comprende además un E! no humano.

6. Una célula de mamífero no humano que tiene un genoma que comprende segmentos génicos VL, DH y JL humanos unidos operativamente a una región C de cadena pesada no humana, en la que dicha región C de cadena pesada no humana comprende una bisagra, un CH2 y un segmento génico CH3 y está sustancial o completamente desprovista de un segmento de dominio CH1 y en la que dicho genoma codifica un anticuerpo de dominio VL individual quimérico de acuerdo con la reivindicación 1.

7. La célula de acuerdo con la reivindicación 6, en la que

(1) el segmento génico VL humano es un segmento génico VK o un segmento génico VA;

(2) los segmentos génicos CH2 y CH3 no humanos son segmentos génicos Cy, en la que la célula opcionalmente comprende además segmentos génicos C! y/o segmentos génicos Co; o

(3) el segmento génico JL humano es un segmento génico JK o un segmento génico JA.

8. Un kit para producir una célula de mamífero no humano competente con la recombinación homóloga que tiene un genoma que codifica un anticuerpo de dominio VL individual quimérico de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

bien:

(1) una primera construcción que comprende un segmento génico VL humano, un primer sitio loxP y un primer conjunto de secuencias de polinucleótidos que flanquean el segmento génico VL y el primer sitio loxP, en donde dicho primer conjunto de secuencias de polinucleótidos de flanqueo es homólogo con respecto a un primer conjunto

de secuencias de ADN endógeno, en donde dicho primer conjunto de secuencias de ADN endógeno está ubicado bien en una región de VH endógena o bien en posición 5´ con respecto a una región de VH endógena y

(2) una segunda construcción que comprende un segundo sitio loxP, un segmento génico JL humano, una región C de cadena pesada no humana y un segundo conjunto de secuencias de polinucleótidos que flanquean la región C de

cadena pesada no humana y el segundo sitio loxP, en donde dicha región C de cadena pesada no humana comprende una bisagra, un CH2 y un segmento génico CH3 y está sustancial o completamente desprovista de un segmento de dominio CH1 y en donde dicho segundo conjunto de secuencias de polinucleótidos de flanqueo es homólogo con respecto a un segundo conjunto de secuencias de ADN endógeno, en el que el extremo 3´ de la secuencia 5´ de polinucleótidos de flanqueo del segundo sitio loxP corresponde a una secuencia endógena 3´ de la mayoría del gen 3´ VH endógeno y el extremo 5´ de la secuencia 3´ de polinucleótidos de flanqueo del segmento génico CH3 corresponde a una secuencia endógena 3´ de la mayoría del segmento 3´ génico de región constante del locus IgH endógeno,

en el que la primera construcción o la segunda construcción además comprenden un segmento génico DH humano y en el que el segmento génico DH está entre el segmento génico VL humano y el primer sitio loxP o el segmento génico DH está entre el segundo sitio loxP y el segmento génico JL humano;

o bien:

(1) una primera construcción que comprende un segmento génico VL humano, un segmento génico DH humano, un segmento génico JL humano, un primer sitio loxP y un primer conjunto de secuencias de polinucleótidos que flanquean el segmento génico VL y el primer sitio loxP, en donde el segmento génico DH está entre el segmento génico VL humano y el segmento génico JL humano, en donde dicho primer conjunto de secuencias polinucleotídicas de flanqueo es homólogo con respecto a un primer conjunto de secuencias de ADN endógeno y en donde dicho primer conjunto de secuencias de ADN endógeno está ubicado bien en una región de VH endógena o bien en posición 5´con respecto a una región de VH endógena y

(2) una segunda construcción que comprende un segundo sitio loxP, una región C de cadena pesada no humana y

un segundo conjunto de secuencias de polinucleótidos que flanquean la región C de cadena pesada no humana y el segundo sitio loxP, en donde dicha región C de cadena pesada no humana comprende una bisagra, un CH2 y un segmento génico CH3 y está sustancial o completamente desprovista de un segmento de dominio CH1 y en el que dicho segundo conjunto de secuencias de polinucleótidos de flanqueo es homólogo con respecto a un segundo conjunto de secuencias de ADN endógeno, en donde el extremo 3´ de la secuencia 5´ de polinucleótidos de flanqueo del segundo sitio loxP corresponde a una secuencia endógena 3´ de la mayoría del gen 3´ VH endógeno y el extremo 5´ de la secuencia 3´ de polinucleótidos de flanqueo del segmento génico CH3 corresponde a una secuencia 3´ endógena de la mayoría del segmento 3´ génico de región constante del locus IgH endógeno.

9. Un mamífero no humano que tiene un genoma que comprende segmentos génicos VL, DH y JL humanos, unidos operativamente a una región C de cadena pesada no humana, en donde dicha región C de cadena pesada no humana comprende una bisagra, un CH2 y un segmento génico CH3 y está sustancial o completamente desprovista de un segmento de dominio CH1 y en el que dicho mamífero es capaz de producir un anticuerpo de dominio VL individual quimérico de acuerdo con la reivindicación 1.

10. El mamífero no humano de acuerdo con la reivindicación 9, en el que:

(1) el segmento génico VL humano es un segmento génico VK o un segmento génico VA;

(2) los segmentos génicos CH2 y CH3 no humanos son segmentos génicos C!, en donde el genoma opcionalmente comprende además segmentos génicos Cy y/o segmentos génicos Co;

(3) los segmentos génicos CH2 y CH3 no humanos no son segmentos génicos C!;

(4) el segmento génico JL humano es un segmento génico JK o un segmento génico JA; o

(5) el mamífero es un ratón.

11. Una célula de hibridoma capaz de producir un anticuerpo de dominio VL individual quimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el hibridoma procede de un mamífero no humano de acuerdo con la reivindicación 9.

12. Un procedimiento para producir una célula de mamífero no humano competente con la recombinación homóloga que comprende un genoma que codifica el anticuerpo de dominio VL individual quimérico de acuerdo con la reivindicación 1 o un mamífero no humano capaz de producir un anticuerpo de dominio VL individual quimérico de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende las etapas de:

(A) proporcionar una primera construcción que comprende un segmento génico VL, un primer sitio loxP y un primer conjunto de secuencias de polinucleótidos que flanquean el segmento génico VL y el primer sitio loxP, en donde dicho primer conjunto de secuencias de polinucleótidos de flanqueo es homólogo con respecto a un primer conjunto de secuencias de ADN endógeno, en el que dicho primer conjunto de secuencias de ADN endógeno está ubicado bien en una región de VH endógena o bien en posición 5´con respecto a una región de VH endógena;

introducir dicha primera construcción en una célula de mamífero no humano competente con la recombinación homóloga y bien:

(1) sustituir una parte de la región VH endógena con el segmento génico VL humano y el primer sitio loxP por medio de recombinación homóloga, en el que dicha parte de la región VH endógena comprende la secuencia de ADN entre dicho primer conjunto de secuencias de ADN endógeno y en donde dicho primer sitio loxP está en posición 3´ de dicho segmento génico VL humano, o

(2) sustituir una parte de la secuencia 5´ con respecto a la región VH endógena con el segmento génico VL humano y el primer sitio loxP por medio de recombinación homóloga, en donde dicho primer sitio loxP está en posición 3´ de dicho segmento génico VL humano y en posición 5´ del primer segmento génico VH endógeno;

proporcionar una segunda construcción que comprende un segundo sitio loxP, un segmento génico JL humano, una región C de cadena pesada no humana y un segundo conjunto de secuencias de polinucleótidos que flanquean la región C de cadena pesada no humana y el segundo sitio loxP, en el que dicha región C de cadena pesada no humana comprende una bisagra, un CH2 y un segmento génico CH3 y está sustancial o completamente desprovista de un segmento de dominio CH1 y en donde dicho segundo conjunto de secuencias de polinucleótidos de flanqueo es homólogo con respecto al segundo conjunto de secuencias de ADN endógeno, en el que el extremo 3´ de la secuencia 5´ de polinucleótidos de flanqueo del segundo sitio loxP corresponde a una secuencia endógena 3´ de la mayoría del segmento 3´ génico VH endógeno y el extremo 5´ de la secuencia 3´ de polinucleótidos de flanqueo del segmento génico CH3 corresponde a una secuencia endógena 3´ de la mayoría del segmento 3´ génico de la región constante del locus IgH endógeno;

introducir dicha segunda construcción en el interior de la célula y bien:

(1) sustituir una parte del locus 3´ IgH endógeno de la mayoría del segmento 3´ génico VH endógeno con el segmento génico JL humano, la región C de cadena pesada no humana y el segundo sitio loxP, en el que dicha parte del locus IgH endógeno comprende la secuencia de ADN entre dicho segundo conjunto de secuencias de ADN endógeno y en donde dicho segundo sitio loxP está en posición 5´ del segmento génico JL humano o bien

(2) sustituir una parte de la secuencia 3´ endógena de la mayoría del segmento 3´ génico de región constante endógena, en donde dicho segundo sitio loxP está en posición 5´ del segmento génico JL humano,

en donde la primera construcción o la segunda construcción comprende además un segmento génico DH humano y en donde el segmento génico DH está entre el segmento génico VL humano y el primer sitio loxP o el segmento génico DH está entre el segundo sitio loxP y el segmento génico JL humano;

retirar la secuencia entre dicho primer sitio loxP y dicho segundo sitio loxP por medio de la CRE recombinasa; y

opcionalmente generar a partir de la célula un mamífero no humano capaz de producir un anticuerpo de dominio VL individual quimérico, o bien

(B) proporcionar una primera construcción que comprende un segmento génico VL humano, un segmento génico DH humano, un segmento génico JL humano, un primer sitio loxP, y un primer conjunto de secuencias de polinucleótidos que flanquean el segmento génico VL y el primer sitio loxP, en donde el segmento génico DH está entre el segmento génico VL humano y el segmento génico JL humano, en donde dicho primer conjunto de secuencias de polinucleótidos de flanqueo es homólogo con respecto a un primer conjunto de secuencias de ADN endógeno, en donde dicho primer conjunto de secuencias de ADN endógeno está ubicado bien en la región de VH endógeno o bien en posición 5´ con respecto a la región de VH endógeno;

introducir dicha primera construcción en el interior de una célula de mamífero no humano competente con la recombinación homóloga y bien:

(1) sustituir una parte de la región VH endógena con el segmento génico VL humano, el segmento génico DH humano, el segmento génico JL humano y el primer sitio loxP por medio de recombinación homóloga, en donde dicha parte de la región VH endógena comprende la secuencia de ADN entre dicho primer conjunto de secuencias de ADN endógeno y en donde dicho primer sitio loxP está en posición 3´ de dicho segmento génico JL humano, o bien

(2) sustituir una parte de la secuencia 5´ con respecto a la región VH endógena con el segmento génico VL humano, el segmento génico DH humano, el segmento génico JL humano y el primer sitio loxP por medio de recombinación homóloga, en la que dicho primer sitio loxP está en posición 3´ de dicho segmento génico JL humano y en posición 5´ del primer segmento génico VH endógeno;

proporcionar una segunda construcción que comprende un segundo sitio loxP, una región C de cadena pesada no humana y un segundo conjunto de secuencias de polinucleótidos que flanquean la región C de cadena pesada no humana y el segundo sitio loxP, en donde dicha región C de cadena pesada no humana comprende una bisagra, un CH2 y un segmento génico CH3 y está sustancial o completamente desprovista de un segmento de dominio CH1 y en el que dicho segundo conjunto de secuencias de polinucleótidos de flanqueo es homólogo con respecto al segundo conjunto de secuencias de ADN endógeno, en el que el extremo 3´ de la secuencia 5´ de polinucleótidos de flanqueo del segundo sitio loxP corresponde a una secuencia endógena 3´ de la mayoría del segmento 3´ génico VH endógeno y el extremo 5´ de la secuencia 3´ de polinucleótidos de flanqueo del segmento génico CH3 corresponde a una secuencia endógena 3´ de la mayoría del segmento 3´ génico de la región constante del locus IgH endógeno;

introducir dicha segunda construcción en el interior de la célula y bien:

(1) sustituir una parte del locus 3´ IgH endógeno de la mayoría del segmento 3´ génico VH endógeno con la región C de cadena pesada no humana y el segundo sitio loxP, en donde dicha parte del locus IgH endógeno comprende la secuencia de ADN entre dicho segundo conjunto de secuencias de ADN endógeno y en el que dicho segundo sitio loxP está en posición 5´ de la región C de cadena pesada, o bien

(2) sustituir una parte de la secuencia 3´ endógena de la mayoría del segmento 3´ génico de región constante endógena, en la que dicho sitio loxP está en posición 5´ de la región C de cadena pesada no humana;

retirar la secuencia entre el primer sitio loxP y el segundo sitio loxP por medio de CRE recombinasa; y

opcionalmente generar a partir de la célula un mamífero no humano de knock-in capaz de producir un anticuerpo de dominio VL individual quimérico.

13. El kit de acuerdo con la reivindicación 8 o el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la primera construcción comprende un primer marcador de selección y/o identificación y en el que la segunda construcción comprende un segundo marcador de selección y/o identificación.

14. Un procedimiento para detectar un antígeno diana que comprende detectar el anticuerpo de dominio VL individual quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con un agente de detección secundario que reconoce una parte del anticuerpo de dominio VL individual, en donde la parte opcionalmente comprende un dominio constante del anticuerpo de dominio VL individual.