Gelificación acelerada de fibroína regenerada.

Un proceso para la gelificación de fibroína de seda regenerada (RSF) para obtener un gel con estructura porosa,

que comprende las etapas de:

a) ajustar el pH de la disolución de fibroína de seda regenerada a pH 5-7, y ajustar su concentración en elintervalo de 0,1 a 40%;

b) agregar el agente gelificante que se selecciona del grupo que consiste en sílice, TiO2, FeO2SiN3 ehidroxiapatita, preferiblemente sílice y mantener la temperatura en el intervalo de 20-70 ºC para obtener gel RSF.

Gelificación acelerada de fibroína regenerada.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un proceso para la aceleración de la gelificación de fibroína regenerada. La presente invención se refiere además a un proceso para usar un agente tal como sílice para crear una estructura porosa de fibroína regenerada.

Antecedentes de la invención Se sabe que los geles de fibroína de seda regenerada (RSF) tienen microestructuras porosas que se pueden ajustar para obtener propiedades mecánicas controlables. La alta resistencia del gel de fibroína, su porosidad y su biocompatibilidad lo hacen un biomaterial potencialmente interesante para aplicaciones tales como estructuras porosas 3D para la ingeniería de tejidos.

El tiempo de gelificación de RSF depende del pH y la concentración de fiboína en disolución. La posible importancia de los geles de fibroína se encuentra en investigación biomédica en los casos en que el pH deseado es 7, 2-7, 4 para el crecimiento celular. Se observa que RSF de concentraciones en el intervalo de 1 a 10 g/L puede requerir hasta 30 a 60 días a pH 7 para la gelificación mientras que RSF de mayor concentración de proteínas en el intervalo de 10 a 100 g/L requiere de 10 a 20 días a pH 7 para convertirse en un gel (Remitirse a la figura 1) . Los geles de RSF preparados a partir de disoluciones de mayor concentración de proteínas no tienen una porosidad adecuada para el acceso y crecimiento celular. Por lo tanto, se desea crear geles microporosos de RSF de menor concentración de proteínas a pH 7. La exposición prolongada a intervalos de temperatura mayores da como resultado la precipitación de proteínas y la pérdida de estructura microporosa, lo que no se desea para la aplicación prevista para RSF> Se necesita un tiempo considerablemente prolongado para la gelificación de tales disoluciones durante el cual se observa crecimiento fúngico en disolución/gel de seda si no se mantiene un ambiente aséptico. En vista de su potencial aplicación en la ingeniería de tejidos, es necesario poder evitar el uso de agente antifúngico para que la línea celular no se someta a un ambiente tóxico. Por lo tanto, existe una necesidad de disminuir el tiempo de gelificación de RSF a pH 7 y temperatura ambiente. A. Lele et al en un póster del International Congress on Rheology, 3-8 de agosto de 2008 y en Phys. Chem. Chem. Phys., 2010, 12, 3834-3844 estudiaron el mecanismo de gelificación de la disolución de fibroína regenerada. También estudiaron la estructura y características de los hidrogeles de seda formados.

Se puede hacer referencia a un artículo llamado "Silk Polymer Designs for Improved Expression and Processing" de Dr. David L. Kaplan, que describe el control de la gelificación de seda en donde la gelificación de fibroína de seda depende de la concentración de fibroína de seda, temperatura y pH de la formación de gel y la estructura de proteína que se puede relacionar con rasgos específicos de secuencia principal en la organización molecular de la proteína de fibroína. Además, dicho artículo también describe sistemas de nanocompuestos inorgánicos de seda sílice en donde se estudió la clonación, expresión y función de fusiones de seda-R5 para la formación de nanocompuestos de sílice.

Se puede hacer referencia a un artículo llamado "Novel nanocomposites from spider silk-silica fusion (chimeric) proteins" por Wong etal., 2006, que describe un enfoque novedoso de nanocompuestos biomiméticos para sintetizar los compuestos de sílice usando proteínas de fusión (quiméricas) . Las proteínas de fusión han encontrado aplicaciones en un amplio espectro de áreas tales como el campo biomédico [que incluye inmunología, investigación de cáncer y administración de fármacos (17-20) ] y ciencia de materiales [materiales automontados (p. ej. geles) , bioconjugados de puntos cuánticos, sensores y síntesis de materiales inorgánicos (21-27) ].

Se puede hacer referencia a un artículo llamado "Composite Material Made of Regenerated Silk Fibroin and Silica Sol" de Cheng Cheng et al. publicado en octubre de 2008 que describe que se mezcló una disolución de fibroína de seda regenerada y sol de sílice para producir los materiales compuestos de fibroína de seda/sílice. Para investigar si existe una interacción entre la proteína de seda y sílice y además, si la interacción puede mejorar las propiedades mecánicas de los materiales compuestos, se estudió la estructura y las propiedades del material compuesto de fibroína de seda/sílice por análisis mecánico dinámico (DMA) junto con microscopía de barrido de electrones (SEM) y espectroscopía Raman. Los resultados de SEM revelaron la buena compatibilidad entre la fibroína de seda y sílice en el compuesto. Las partículas de sílice de nanotamaño se dispersaron uniformemente en las matrices continuas de fibroína de seda. El espectro Raman de los materiales compuestos indicó que la fibroína de seda estaba dominada por una conformación de láminas beta. En comparación con el material de fibroína de seda pura, los compuestos mostraron mejores propiedades mecánicas dinámicas.

Se puede hacer referencia a la solicitud de patente WO 200512606, en donde la solicitud reivindica disoluciones de fibroína de seda acuosas y un proceso para prepararlas, un método para producir una fibra, espuma de seda, película e hidrogeles de seda. En la página 30 de dicha solicitud PCT se discute el estudio de la influencia de los iones, pH, temperatura y PEO sobre la gelificación de la disolución de fibroína de seda.

El estudio de la técnica anterior revela que no hay ningún documento que enseñe el proceso de aceleración de la gelificación, disminuyendo así el tiempo de gelificación. Particularmente ningún documento de la técnica anterior enseña el proceso de aceleración del tiempo de gelificación de fibroína de seda que usa un agente de aceleración.

Objetivo de la invención El objetivo principal de la presente invención es disminuir el tiempo de gelificación de los geles RSF para completar las definiciencias de la técnica.

Otro objetivo de la presente invención es disminuir el tiempo de gelificación de RSF usando un proceso que no provoca crecimiento microbiano en el medio de gel.

Aun otro objetivo de la presente invención es disminuir el tiempo de gelificación por un proceso para que no sea tóxico para las líneas celulares.

Sumario de la invención Por consiguiente, la presente invención proporciona un proceso para acelerar la gelificación de fibroína de seda regenerada (RSF) con estructura porosa, que comprende las etapas de:

a) ajustar el pH de la disolución de fibroína de seda regenerada a pH 5-7, 5 y ajustar su concentración en el intervalo de 0, 1 a 40%.

b) agregar el agente gelificante que se selecciona del grupo que consiste en sílice, TiO2, FeO2SiN3, hidroxiapatita, preferiblemente sílice, de concentración deseada y mantener la temperatura en el intervalo de 2070 ºC.

En otra realización de la presente invención, dicha gelificación se realiza opcionalmente por autosiembra con láminas de una proteína, en condiciones alcalinas, preferiblemente proteína de fibroína.

En aun otra realización de la presente invención, dicho agente gelificante se usa en el intervalo de concentración de 1 g/l a 25 g/l, preferiblemente 1 a 5 g/l.

En aun otra realización de la presente invención, el tamaño de partículas de dicho agente gelificante se encuentra en el intervalo de 1 nm-1μm, preferiblemente 1 nm a 400 nm.

En aun otra realización de la presente invención, el gel de fibroína de seda regenerada tiene estructura porosa, el tamaño de poros de dicho gel se encuentra en el intervalo de 1-10 micrómetros.

En aun otra realización de la presente invención, el gel de fibroína de seda regenerada tiene estructura porosa, dicho gel comprende paredes nanoporosas de una porosidad que varía en el intervalo de 1 a 500 nm.

En aun otra realización de la presente invención, el gel de fibroína de seda regenerada tiene estructura porosa, dicho gel está libre de crecimiento microbiano.

Breve descripción de las figuras

Fig 1: Tiempo de gelificación de RSF a varios pH (D. Kaplan, JPC B, 110, 2006, 21630- 21638) .

Fig 2: Estudio de dicroísmo circular en sol de RSF y gel RSF que contiene varias nanopartículas de sílice de la invención a pH 7 y 25 ºC. Fig 3: Mediciones de módulo de comprensión en geles RSF de la invención con y sin nanopartículas. Fig 4: Módulo de compresión y estudio de tiempo de gelificación de 5 g/L de gel RSF en presencia de varias

concentraciones de nanopartículas.

Fig 5: Imagen de CSLM de gel RSF a una concentración... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para la gelificación de fibroína de seda regenerada (RSF) para obtener un gel con estructura porosa, que comprende las etapas de:

a) ajustar el pH de la disolución de fibroína de seda regenerada a pH 5-7, 5 y ajustar su concentración en el intervalo de 0, 1 a 40%;

b) agregar el agente gelificante que se selecciona del grupo que consiste en sílice, TiO2, FeO2SiN3 e hidroxiapatita, preferiblemente sílice y mantener la temperatura en el intervalo d.

2. 70 ºC para obtener gel RSF.

2. El proceso según la reivindicación 1, en donde dicha gelificación se realiza opcionalmente por autosiembra con láminas de una proteína, en condiciones alcalinas, preferiblemente proteína de fibroína.

3. El proceso según la reivindicación 1, en donde dicho agente gelificante se usa en el intervalo de concentración de 10 1 g/l a 25 g/l, preferiblemente 1 a 5 g/l.

4. El proceso según la reivindicación 1, en donde el tamaño de partículas de dicho agente gelificante se encuentra en el intervalo de 1 nm-1 μm, preferiblemente 1 nm a 400 nm.