Formulaciones de los conjugados de PEG-interferón alfa.

Una formulación que comprende conjugados de PEG-Interferón alfa,

un tampón, un agente estabilizante, unagente crioprotector y un disolvente, en la que dicho tampón se selecciona a partir de fosfato sódico, succinatosódico, succinato potásico, cloruro de histidina, glicinato sódico ya sea solo o en combinación, y en el que el agentecrioprotector es lactosa.

Formulaciones de los conjugados de PEG-interferón alfa Campo de la invención La presente invención se refiere a las nuevas formulaciones liofilizadas y estabilizadas de conjugados de PEGinterferón alfa y los procedimientos para su preparación.

Antecedentes de la invención.

La principal desventaja en el uso terapéutico de la mayoría de los compuestos biológicos es que se administran a través de ruta parenteral, p.ej. de forma intravenosa (i.v.) , subcutánea (s.c.) , intramuscular (i.m.) , etc., lo que significa que la liberación en el paciente se asocia con dolor y malestar. Es más, a causa de sus muy cortas vidas medias, los biológicos requieren frecuentes administraciones en el paciente con el fin de mantener los niveles sanguíneos terapéuticos del fármaco. Muchos tipos de inyecciones que no se pueden auto administrar, requieren viajes frecuentes a la clínica, además de añadir incomodidad al paciente. Existen múltiples tipos de ejemplos de fármacos biológicos que requieren de una frecuente administración. El interferón alfa-2a (Roferon, Roche) y el interferón alfa2b (Intron A, Shering AG) , las dos formas recombinantes del interferón alfa, usados en el tratamiento de las hepatitis crónicas B y C tienen una vida media menor a 12 h (McHutchison, et al., Engl. J.Med. 1998, 339, 1485-1492; Glue, et al., Clin. Pharmacol. Ther. 2000, 68, 556-567) y en consecuencia requieren una administración de 3 veces a la semana. Se requieren también inyecciones repetidas con interferón beta-1b (Betaseron) para tratar a los pacientes con esclerosis múltiple (EM) . La dosificación recomendada es mediante ruta subcutánea administrada cada dos días. Otro ejemplo de un medicamento que requiere inyecciones repetidas es la filgrastima (factor estimulante de colonias de granulocitos, o G-CSF) , donde se dan las inyecciones cada día con una duración del tratamiento de dos semanas.

Un método muy exitoso y bien aceptado que supera los inconvenientes descritos de frecuentes inyecciones de altas dosis con el fin de mantener los niveles de umbral del medicamento en el cuerpo es el de incrementar la vida media in-vivo de la proteína terapéutica mediante su conjugación con un polímero, preferiblemente polietilenglicol (PEG) . Las moléculas de PEG con sus largas cadenas no solamente crean un escudo protector alrededor de la molécula pegilada del fármaco en solución acuosa reduciendo de esta forma la inmunogenicidad de la proteína farmacológica mientras también las protegen de la acción de las proteasas, sino que también ayudan además a incrementar la vida media del fármaco circulante mediante el aumento de su volumen hidrodinámico el cual reduce su pérdida por los mecanismos de filtración del entramado del glomérulo renal. La parte del PEG se elimina sin ningún cambio estructural tras su separación de la molécula de proteína, y su aclaramiento es proporcional al peso molecular. Desde los años 1970 se ha publicado la conjugación de proteínas a PEG. Por regla general, la fracción de PEG se ancla a la proteína mediante una activación del PEG, en primer lugar, para hacerla reaccionar después con la cadena lateral del residuo de lisina y/o el grupo amino N-terminal de la proteína. El PEG que se usa más frecuentemente es el PEG monofuncional porque su fracción es más resistente a la agregación y al entrecruzamiento. Uno de estos ejemplos se describe en Davis et al. in US Pat. No. 4, 179, 337. Los conjugados PEG-proteína se forman mediante la reacción de un material biológicamente activo con un exceso de concentración molar de un polímero altamente activado que posee un grupo amino terminal de unión sin tener en cuenta dónde se pueda anclar el polímero a la proteína, y dando lugar a una composición peptídica fisiológicamente activa, soluble en agua y no-inmunogénica. La pegilación de los interferónes se ha publicado en U.S. Pat. Nos. 4, 766, 106 and 4, 917, 888 el cual describe entre otros, interferón beta conjugado con polímeros activados incluyendo mPEG-2, 4, 6tricloro-S-triazina, m-PEG-N-succinimidil glutarato o mPEG-N-succinimidil succinato. Una de estas descripciones en U.S. Pat. No. 5, 951, 974 relata la conjugación del interferón a un polímero substancialmente no-antigénico a un sitio de histidina. Otra de estas descripciones en U.S. Pat.No. 5, 981, 709 describe un polímero de interferón alfa conjugado con una relativamente alta vida media circulante.

Algunas proteínas pegiladas terapéuticas disponibles comercialmente incluyen, ADAGEN (adenosindeaminasa bovina pegilada) , la cual se usa para tratar el síndrome de inmunodeficiencia combinada severa ligada al cromosoma X; PEGASYS ( interferón alfa 2a pegilado) , el cual se usa en el tratamiento de la hepatitis C; PEG-Intron (interferón alfa 2b pegilado) para la hepatitis C crónica; Oncaspar (L-aspariginasa pegilada) para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda en pacientes que son hipersensibles a la forma nativa no modificada de la Lasparaginasa; y, Neulasta (metionil factor estimulante de colonias de granulocitos humano recombinante pegilado) para la neutropenia inducida por quimioterapia del cáncer.

El virus de la hepatitis C (HCV) constituye una de las mayores causas de enfermedad hepática en el mundo. Casi 200 millones de personas están afectadas en todo el mundo. El interferón en combinación con ribavirina ha mostrado ser efectivo en la disminución de la carga viral de los pacientes con hepatitis C crónica, sin embargo, se necesita administrarlo 3 veces a la semana. El PEG-interferón alfa es un conjugado covalente de interferón alfa 2b recombinante con monometoxiPEG en una proporción molar 1:1 (Glue P et al., Clin Pharmacol Ther. 2000; 68; 556567) . La vida media promedio de absorción del PEG-interferón alfa 2b es 5 veces mayor que la del interferón alfa 2b no-pegilado. La vida media promedio de eliminación es de 40 horas en pacientes con infección de hepatitis C. Otro producto es el PEG-interferón alfa 2a, el cual tiene una molécula de cadena ramificada de 40 kDa con cada rama de PEG con un peso molecular promedio de 20 kDa. Las dos cadenas de monometoxy PEG están unidas mediante enlaces uretano hidrolíticamente estables a una molécula de lisina conectora, uno en el grupo amino alfa de la lisina y el otro en el grupo amino s de la lisina. La vida media promedio de absorción del PEG-interferón alfa es 10 veces mayor que el interferón alfa no pegilado. La vida media promedio de eliminación es de alrededor de 60 horas en pacientes con infección de hepatitis C. Ambos productos perfeccionados solamente necesitan ser administrados en un régimen de una vez a la semana.

Mientras algunos conjugados polímero-proteína son estables en forma líquida, otros no lo son. Por ejemplo, a diferencia del caso del PEG-interferón alfa 2a donde la pegilación da lugar a un enlace uretano estable, el cual es ante todo estable en medio acuoso, el producto de PEG-interferón alfa 2b, el cual primitivamente contiene un PEG unido a un residuo de histidina (His 34) , es altamente inestable en la forma líquida. Con estos conjugados polímeroproteína se tienen que utilizar técnicas como la liofilización/deshidratación por congelación- un proceso donde se sublima el agua de una composición tras su congelación- el cual puede dar lugar a una forma estable al biológico por encima de un periodo de tiempo deseado. Así, para preparar una formulación estable de PEG-interferón alfa 2b, se necesita liofilizar cuidadosamente la formulación con el (los) agente (es) crioprotector (es) o lioprotector (es) adecuados, y agentes estabilizantes, que estabilicen los conjugados de interferón alfa pegilados para prevenir la despegilación durante el proceso de liofilización- un fenómeno comúnmente asociado con el producto de PEGinterferón alfa. Es más, además de agentes crioprotectores y agentes estabilizantes la formulación liofilizada contiene también incrementadores de volumen que aumentan la cantidad de material sólido en el vial.

Una forma específica en la que se ha resuelto el problema de la inestabilidad del enlace uretano del residuo de His 34 en el caso del PEG-interferón alfa 2b es utilizando una formulación que se ha descrito en U.S. Pat. 6, 180, 096, donde los conjugados de PEG-IFN alfa 2b se liofilizan en presencia de tampón, agentes crioprotectores , un agente estabilizante y un disolvente en cuya formulación contiene un disacárido sacarosa, como agente crioprotector, junto con fosfato sódico monobásico dihidrato y fosfato sódico dibásico anhidro, como tampón, con polisorbato 80 como agente estabilizante, y agua como disolvente. Mientras la formulación de arriba es comercialmente satisfactoria en el tratamiento de la Hepatitis C, está sin embargo asociada con varios problemas, algunos de los cuales se explican... [Seguir leyendo]

4. Todos los factores arriba descritos contribuyen a la rentabilidad del proceso de esta invención. 25

1. Una formulación que comprende conjugados de PEG-Interferón alfa, un tampón, un agente estabilizante, un agente crioprotector y un disolvente, en la que dicho tampón se selecciona a partir de fosfato sódico, succinato sódico, succinato potásico, cloruro de histidina, glicinato sódico ya sea solo o en combinación, y en el que el agente crioprotector es lactosa.

2. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 1, donde el agente estabilizante se selecciona a partir de dodecilsulfato sódico, o polisorbatos adecuados..

3. Una formulación como se reivindica en las reivindicaciones 1 y 2, donde el polisorbato se selecciona a partir de Polisorbato 20, 40 o 80.

4. La formulación como se reivindica en las reivindicaciones del 1 al 3, donde el agente crioprotector comprende además trehalosa.

5. La formulación como se reivindica en las reivindicaciones precedentes, donde la concentración de dichos conjugados de PEG-Interferón alfa es de 0, 03 a 2, 0 mg de interferón por mililitro.

6. La formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho tampón es succinato sódico.

7. La formulación como se reivindica en la reivindicación 6, donde la concentración del tampón succinato sódico está en el intervalo de 0, 001 a 0, 5 molar.

8. La formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el intervalo de pH de dicha formulación está en el intervalo de 4, 0 a 6, 8.

9. La formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, dicho agente estabilizante está presente en una concentración de 0, 01 a 1, 0 mg/ml.

10. La formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la concentración del agente crioprotector está entre 10-100 mg/ml.

11. La formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho disolvente es el agua.

12. La formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la composición comprende además glicina.

13. La formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dichos conjugados de PEG-Interferón alfa comprenden predominantemente moléculas individuales de PEG conjugadas con moléculas individuales de interferón alfa.

14. La formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dichas moléculas de interferón alfa se seleccionan del grupo que consiste en interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón alfa-2c y sus variantes apropiadas.

15. La formulación como se reivindica en la reivindicación 14 precedentes, donde dichas moléculas de interferón alfa son interferón alfa-2b.

16. Un proceso de liofilización de la formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para obtener un polvo liofilizado.

17. Una formulación liofilizada preparada de acuerdo con el proceso de la reivindicación 16.

18. La formulación de la reivindicación 17 donde el polvo liofilizado se reconstituye con agua.