Etiquetas de solubilidad para la expresión y purificación de péptidos bioactivos.

Una etiqueta de cuerpo de inclusión que comprende la estructura general:

Gln-Gln-Xaa1-Phe-Xaa2-Trp-Xaa3-Phe-Xaa4-Xaa5-Gln-Espaciador-[[Gln-Gln-Xaa1-Phe-Xaa2-Trp-Xaa3-Phe-Xaa4-Xaa5-Gln]-[Espaciador]m]n



en la que

Xaa1≥ Arg, His o Lys;

Xaa2≥ Gln, His o Lys;

Xaa3≥ Gln, His o Lys;

Xaa4≥ Glu o Gln;

Xaa5≥ Gln o Lys;

n≥1 a 10;

m≥ n-1; y

Espaciador≥ es un péptido que comprende los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en prolina, arginina,glicina, ácido glutámico y cisteína.

Etiquetas de solubilidad para la expresión y purificación de péptidos bioactivos Campo de la invención La invención se refiere al campo de la expresión y purificación de proteínas de células microbianas. Más específicamente, se proporciona una familia de etiquetas peptídicas pequeñas útiles en la generación de proteínas de fusión insolubles.

Antecedentes de la invención La producción eficaz de proteínas y péptidos bioactivos se ha convertido en una característica distintiva de la industria biomédica y bioquímica industrial.

Los péptidos y proteínas bioactivos se usan como agentes curativos en una variedad de enfermedades tales como diabetes (insulina) , infecciones virales y leucemia (interferón) , enfermedades del sistema inmune (interleuquinas) y deficiencias de células rojas (eritropoyetina) por nombrar algunas. Además, se necesitan grandes cantidades de proteínas y péptidos para varias aplicaciones industriales incluyendo, por ejemplo, las industrias de pulpa y papel y pulpa, industrias alimentarias, industrias del cuidado personal y cosméticas, refinado de azúcar, tratamiento de aguas residuales, producción de bebidas alcohólicas y como catalizadores para la generación de nuevos productos farmacéuticos.

Con el advenimiento del descubrimiento e implementación de tecnologías de cribado de péptidos combinatorias tales como exposición en bacterias (Kemp, D.J.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (7) : 4520-4524 (1981) ; exposición en levaduras (Chien et al., Poc. Natl. Acad, Sci. USA 88 (21) : 9578-82 (1991) , síntesis de péptidos en fase sólida combinatoria (Patente U.S. No. 5.449.754; Patente U.S. No. 5.480.971; Patente U.S. No. 5.585.275 y Patente U.S. No. 5.639.603) , tecnología de exposición en fagos (Patente U.S. No. 5.223.409; Patente U.S. No. 5.403.484; Patente U.S. No. 5.571.698; y Patente U.S. No. 5.837.500) , exposición en ribosomas (Patente U.S. No. 5.643.768; Patente U.S. No. 5.658.754; y Patente U.S. No. 7.074.557) y tecnología de exposición en ARNm (PROFUSION™; Patente U.S. No. 6.258.558; Patente U.S. No. 6.518.018; Patente U.S. No. 6.281.344; Patente U.S. No. 6.214.553; Patente U.S. No. 6.261.804; Patente U.S. No. 6.207.446; Patente U.S. No. 6.846.655; Patente U.S. No. 6.312.927; Patente U.S. No. 6.602.685; Patente U.S. No. 6.416.950; Patente U.S. No. 6.429.300; Patente U.S. No. 7.078.197; y Patente U.S. No. 6.436.665) se han desarrollado nuevas aplicaciones para péptidos que tienen afinidades de unión específicas. En particular, se buscan péptidos como conectores en campos biomédicos para la unión de agentes de diagnóstico y farmacéuticos a superficies (véase Grinstaff et al, Publicación de Solicitud de Patente U.S. No. 2003/0185870 y Linter en Patente U.S. No. 6.620.419) , así como en la industria del cuidado personal para la unión de agentes beneficiosos a superficies corporales tales como pelo y piel (véase la Publ. Solic. Patente U.S. de propiedad común No. 2005/0050656, y Janssen et al. Publicación de Solicitud de Patente U.S. No. 2003/0152976) y en la industria de la impresión para la unión de pigmentos a medios de impresión (véase la Publ. Solic. Patente U.S. de propiedad común No. 2005/0054752) .

En algunos casos, pueden generarse sintéticamente proteínas y péptidos comercialmente útiles o aislarse de fuentes naturales. Sin embargo, estos métodos frecuentemente son costosos, exigen mucho tiempo y se caracterizan por una capacidad limitada de producción. El método preferido para la producción de proteínas y péptidos es mediante la fermentación de organismos construidos recombinantemente, preparados por ingeniería para sobreexpresar la proteína o péptido de interés. Aunque es preferible a la síntesis o aislamiento, la expresión recombinante de péptidos tiene varios obstáculos que hay que superar con el fin de que sea un medio rentable de producción. Por ejemplo, los péptidos (y en particular péptidos cortos) producidos en un entorno celular son susceptibles a la degradación por la acción de proteasas celulares nativas. Además, la purificación puede ser difícil, lo que resulta en rendimientos bajos dependiendo de la naturaleza de la proteína o péptido de interés.

Un medio para mitigar las dificultades anteriores es el uso de quimeras genéticas para la expresión de proteínas y péptidos. Una proteína quimérica o "proteína de fusión" es un polipéptido que comprende al menos una parte del producto proteico deseado fusionada con al menos una parte que comprende una etiqueta peptídica. La etiqueta peptídica puede usarse para ayudar en el plegamiento de la proteína, ayudar en la purificación posterior a la expresión, proteger a la proteína de la acción de enzimas degradantes y/o ayudar a la proteína a pasar a través de la membrana celular.

En muchos casos es útil expresar una proteína o péptido en forma insoluble, particularmente cuando el péptido de interés es bastante corto, normalmente soluble y/o susceptible a degradación proteolítica en la célula huésped. La producción del péptido en forma insoluble facilita una recuperación sencilla a la vez que protege al péptido de la degradación proteolítica indeseable. Un medio para producir el péptido en forma insoluble es producir el péptido recombinantemente como parte de una proteína de fusión insoluble incluyendo en la construcción de fusión al menos una etiqueta peptídica (es decir, una etiqueta de cuerpo de inclusión) que induce la formación de cuerpos de inclusión. Típicamente, la proteína de fusión se diseña para incluir al menos un conector peptídico escindible de manera que el péptido de interés puede recuperarse posteriormente de la proteína de fusión. La proteína de fusión puede diseñarse para incluir una pluralidad de etiquetas de cuerpo de inclusión, conectores peptídicos escindibles y regiones que codifican el péptido de interés.

Las proteínas de fusión que comprenden una etiqueta peptídica que facilita la expresión de proteínas insolubles son muy conocidas en la técnica. Típicamente, la parte de etiqueta de a proteína quimérica o de fusión es grande, lo que incrementa la probabilidad de que la proteína de fusión sea insoluble. El ejemplo de etiquetas peptídicas grandes usadas típicamente incluyen, pero no está limitado a, cloranfenicol acetiltransferasa (Dykes et al., Eur. J. Biochem., 174: 411 (1988) , !-galactosidasa (Schellenberger et al., Int. J. Peptide Protein Res., 41: 326 (1993) ; Shen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 281: 4627 (1984) ; y Kempe et al., Gene, 39: 239 (1985) , glutatión-S-transferasa (Ray et al., Bio/Technology, 11: 64 (1993) y Hancock et al. (WO94/04688) , el N terminal de L-ribuloquinasa (Patente U.S. 5.206.154 y Lai et al., Antimicrob. Agents & Chemo., 37: 1614 (1993) , proteína gp55 del bacteriófago T4 (Gramm et al., Bio/Technology, 12: 1017 (1994) , proteína quetoesteroide isomerasa bacteriana (Kuliopulos et al., J. Am. Chem. Soc. 116: 4599 (1994) , ubiquitina (Pilon et al., Biotechnol. Prog., 13: 374-79 (1997) , proquimosina bacteriana (Haught et al., Biotechnol. Bioengineer. 57: 55-61 (1998) y proteína bactericida/potenciadora de la permeabilidad ("BPI", Better, M.D. y Gavit, PD., Patente U.S. No. 6.242.219) . La técnica está repleta de ejemplos específicos de esta tecnología, véase por ejemplo US 6.613.548, que describe una proteína de fusión de una etiqueta proteínica y una proteína soluble y la purificación posterior del lisado celular; US 6.037.145, que enseña una etiqueta que protege a la proteína quimérica expresada de una proteasa específica; Patente U.S. No. 5.648.244, que enseña la síntesis de una proteína de fusión que tiene una etiqueta y un conector escindible para una purificación fácil de la proteína deseada; y Patente U.S. No. 5.215.896; Patente U.S. No. 5.302.526; Patente U.S. No. 5.330.902; y Publicación de Solicitud de Patente U.S. No. 2005/221444, que describe etiquetas de fusión que contienen composiciones de aminoácidos diseñadas específicamente para incrementar la insolubilidad de la proteína o péptido quimérico.

Recientemente se han desarrollado etiquetas de cuerpo de inclusión más cortas a partir de la proteína zeína de Zea mays (Publ. Solic. Patente U.S. en co-propiedad No. 2008/0096246) , la cistatina de Daucus carota (Publ. Solic. Patente U.S. en co-propiedad No. 2008/0096245) , y una proteína hipotética semejante a amiloide de Caenorhabditis elegans (Publ. Solic. Patente U.S. en co-propiedad No. 2008/0206809) . El uso de etiquetas de cuerpo de inclusión cortas incrementa el rendimiento del péptido diana producido en la célula huésped recombinante.

El problema a resolver es proporcionar etiquetas de solubilidad que sean eficaces para la preparación de proteínas de fusión que comprenden un péptido... [Seguir leyendo]

1. Una etiqueta de cuerpo de inclusión que comprende la estructura general:

Gln-Gln-Xaa1-Phe-Xaa2-Trp-Xaa3-Phe-Xaa4-Xaa5-Gln-Espaciador-[[Gln-Gln-Xaa1-Phe-Xaa2-Trp-Xaa3-Phe-Xaa4Xaa5-Gln]-[Espaciador]m]n en la que Xaa1= Arg, His o Lys; Xaa2= Gln, His o Lys; Xaa3= Gln, His o Lys; Xaa4= Glu o Gln; Xaa5= Gln o Lys; n=1 a 10; m= n-1; y Espaciador= es un péptido que comprende los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en prolina, arginina,

glicina, ácido glutámico y cisteína.

2. La etiqueta de cuerpo de inclusión de la reivindicación 1 que comprende además al menos un resto de cisteína entrecruzable que comprende SEQ ID NO: 33.

3. La etiqueta de cuerpo de inclusión de la reivindicación 1 que comprende además al menos un resto de cisteína entrecruzable localizado en el extremo amino o el extremo carboxi de dicha etiqueta de cuerpo de inclusión.

4. La etiqueta de cuerpo de inclusión de la reivindicación 1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 265.

5. Un péptido de fusión que comprende la etiqueta de cuerpo de inclusión de la reivindicación 1 o reivindicación 2 unida de manera operativa al menos a un péptido de interés.

6. El péptido de fusión de la reivindicación 5 que comprende además al menos un sitio de escisión que separa la etiqueta de cuerpo de inclusión del al menos un péptido de interés.

7. El péptido de fusión de la reivindicación 6 en el que el péptido de interés se selecciona del grupo que consiste en un péptido de unión a polímeros, un péptido de unión a pelo, un péptido de unión a uñas, un péptido de unión a piel, un péptido de unión a diente, un péptido antimicrobiano, un péptido de unión a arcilla, un péptido de unión a pigmento y un péptido de unión a celulosa.

8. Una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de fusión que comprende la etiqueta de cuerpo de inclusión de la reivindicación 1 o reivindicación 2 unida de manera operativa al menos a un péptido de interés.

9. Un casete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8.

10. Un vector que comprende el casete de expresión de la reivindicación 9.

11. Una célula huésped microbiana que comprende el vector de lareivindicación 10.

12. La célula huésped microbiana de la reivindicación 11, en la que la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en Aspergillus, Trichoderma, Saccharomyces, Pichia, Yarrowia, Candida, Hansenula, Salmonella, Bacillus, Acinetobacter, Zymomonas, Agrobacterium, Er y throbacter, Chlorobium, Chromatium, Flavobacterium, Cytophaga, Rhodobacter, Rhodococcus, Streptomyces, Brevibacterium, Cor y nebacteria, Mycobacterium, Deinococcus, Escherichia, Erwinia, Pantoea, Pseudomonas, Sphingomonas, Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus,

Methylomicrobium, Methylocystis, Alcaligenes, Synechocystis, Synechococcus, Anabaena, Thiobacillus, Methanobacterium, Klebsiella y Myxococcus.

13. Un método para expresar un péptido en forma insoluble que comprende:

a) sintetizar una construcción genética expresable que codifica un péptido de fusión que comprende una primera parte que codifica la etiqueta de cuerpo de inclusión de la reivindicación 1 o reivindicación 2 unida de manera operativa a una segunda parte que codifica un péptido de interés;

b) transformar una célula huésped de expresión con la construcción genética de (a) ;

c) crecer la célula huésped transformada de (b) en condiciones en las que se exprese la construcción genética expresable y el péptido de fusión codificado se produzca en una forma insoluble; y

d) recuperar dicho péptido de fusión en dicha forma insoluble.

14. Un método para la producción de un péptido de interés que comprende:

a) sintetizar una construcción genética que codifica un péptido de fusión que comprende una primera parte que codifica la etiqueta de cuerpo de inclusión de la reivindicación 1 o reivindicación 2 unida de manera operativa a una segunda parte que codifica al menos un péptido de interés; en el que dicha primera parte y dicha segunda parte están separadas por al menos un conector peptídico escindible;

b) transformar una célula huésped de expresión con la construcción genética de (a) ;

c) crecer la célula huésped transformada de (b) en condiciones en las que se exprese la construcción genética y el 15 péptido de fusión codificado se produzca en una forma insoluble;

d) recuperar el péptido de fusión en dicha forma insoluble;

e) escindir dicho péptido de fusión dicho al menos un conector peptídico escindible mediante lo cual dicha primera parte del péptido de fusión no está ya fusionada con dicha segunda parte; y

f) recuperar dicho péptido de interés.

15. El método bien de 13 ó 14 en el que el péptido de interés se selecciona del grupo que consiste en un péptido de unión a polímeros, un péptido de unión a pelo, un péptido de unión a uñas, un péptido de unión a piel, un péptido de unión a diente, un péptido de unión a arcilla, un péptido de unión a pigmento, un péptido de unión a celulosa y un péptido antimicrobiano.