Enzimas modificadas inmovilizadas con una elevada tolerancia frente a sustratos hidrófilos en medios orgánicos.

Una enzima interfacial modificada inmovilizada sobre un soporte sólido hidrófobo,

en la que la enzima es unalipasa, una esterasa o una fosfolipasa y en la que dicha enzima está recubierta con grupos lipídicos unidoscovalentemente, estando así rodeada por un microentorno hidrófobo y protegida de la desactivación y/o de laagregación en presencia de agentes, sustratos y/o productos de reacción hidrófilos, en la que dicho recubrimientocon grupos lipídicos se consigue mediante la unión covalente de epóxidos lipídicos a los grupos funcionales de lasuperficie de la enzima a través de su grupo epoxi original.

Enzimas modificadas inmovilizadas con una elevada tolerancia frente a sustratos hidrófilos en medios orgánicos Campo de la invención La presente invención se refiere a enzimas interfaciales inmovilizadas, particularmente a lipasas y a fosfolipasas, así como a otras hidrolasas, con una actividad y una estabilidad mejoradas frente a alcoholes, en particular alcoholes de cadena corta, así como otras sustancias hidrófilas. La invención también se refiere a procedimientos de preparación de dichas enzimas, y a sus diversos usos industriales y de investigación, particularmente para la producción de ésteres metílicos de ácidos grasos, típicamente usados como biodiésel.

Antecedentes de la invención Las enzimas interfaciales son una clase de enzimas que comprenden dos dominios en su estructura proteica; el primero es un dominio hidrófilo, mientras que el segundo es un dominio hidrófobo. Esta característica única permite que esta clase de enzimas favorezca el área interfacial una vez presente en un sistema bifásico. En estas condiciones se forma la conformación activa en la que el dominio hidrófilo de las moléculas de la enzima se orienta hacia la capa acuosa mientras que el dominio hidrófobo se orienta hacia la capa hidrófoba.

Las lipasas y las fosfolipasas son las enzimas interfaciales más familiares que expresan su actividad catalítica una vez presentes en un sistema interfacial. Las lipasas (hidrolasa de triacilglicerol E.C. 3.1.1.3) se definen como enzimas hidrolíticas que actúan sobre el enlace éster del triacilglicerol en sistemas acuosos para producir ácidos grasos libres, glicéridos parciales y glicerol. Las fosfolipasas también pertenecen a la clase de las enzimas hidrolíticas, sin embargo escinden favorablemente y específicamente el enlace éster de los fosfolípidos presentes en sistemas acuosos, para producir ácidos grasos libres, lisofosfolípidos, glicerofosfolípidos, ácido fosfatídico y alcohol libre, dependiendo del tipo de fosfolipasa.

Las lipasas y las fosfolipasas están ampliamente distribuidas en animales, plantas y microorganismos. El interés en la aplicación industrial de las lipasas y de las fosfolipasas ha crecido rápidamente durante las últimas dos décadas. Se ha averiguado que en una actividad con poca agua, esta clase de enzimas cataliza su reacción de hidrólisis inversa. La actividad catalítica inversa de las lipasas y las fosfolipasas ha sido ampliamente explotada para la síntesis de valiosos compuestos que contienen enlaces éster y amida u otros compuestos químicos relacionados que contienen grupos funcionales tales como hidroxilo, carboxílico y grupos amino. En particular, las lipasas y las fosfolipasas se han utilizado para la reformulación de grasas, aceites, ceras, fosfolípidos y que esfingolípidos para obtener unas nuevas propiedades funcionales deseadas, y para separar compuestos ópticamente activos a partir de sus mezclas racémicas. Es de particular interés el uso de enzimas interfaciales para la síntesis de ésteres alquílicos de cadena corta (biodiésel) , desvelados en este documento.

Actualmente existen más de 40 lipasas y fosfolipasas diferentes disponibles comercialmente, aunque sólo unas pocas de ellas están preparadas en cantidades comerciales. Algunas de las enzimas interfaciales más prometedoras industrialmente derivan de Candida antarctica, Candida rugosa, Rhizomucor miehei, Pseudomonas sp., Rhizopus niveus, Mucor javanicus, Rhizopus or y zae, Aspergillus niger, Penicillium camembertii, Alcaligenes sp., Burkholderia sp., Thermomyces lanuginosa, Chromobacterium viscosum, semillas de papaya y pancreatina.

La inmovilización de las enzimas ha sido descrita por un amplio número de técnicas que aspiran básicamente a reducir el coste de la contribución de las enzimas en el procedimiento global, facilitando la recuperación de las enzimas a partir de los productos y permitiendo una operación continua del procedimiento. Las técnicas de inmovilización se dividen en general según lo siguiente:

1. Adsorción física de enzimas en soportes sólidos, tales como sílice y polímeros insolubles.

2. Adsorción en resinas de intercambio iónico.

3. Unión covalente de las enzimas sobre un material de soporte sólido, tal como un soporte inorgánico epoxidado

o polimérico.

4. Atrapamiento de las enzimas en un polímero en crecimiento.

5. Confinamiento de las enzimas en un reactor de membrana o en geles semipermeables.

6. Reticulación de cristales (CLECS’s) o de agregados enzimáticos (CLEAS’s) .

Todos los procedimientos de inmovilización de enzimas mencionados anteriormente comprenden las siguientes etapas:

1. Disolver la enzima en un sistema tamponante apropiado con respecto al pH, la temperatura, el tipo de sal tamponante y la fuerza iónica.

2. Añadir el soporte sólido a la disolución de la enzima y mezclar durante un tiempo hasta que las moléculas de enzima estén inmovilizadas sobre el soporte sólido.

3. Filtrar el soporte sólido que contiene la enzima inmovilizada.

4. Lavar el soporte con un tampón apropiado para eliminar las moléculas de enzima unidas débilmente y después secar el soporte sólido.

Las enzimas interfaciales, en su mayor parte lipasas, han sido inmovilizadas siguiendo las técnicas mencionadas anteriormente. Estas preparaciones de enzima inmovilizada ofrecidas poseen una baja actividad sintética y/o un tiempo de semivida operativa corto. En un intento de aumentar la actividad sintética de las lipasas movilizadas y de otras enzimas interfaciales se han aplicado diferentes procedimientos de activación. Estos procedimientos incluyen:

1. Unir los grupos funcionales de la superficie de las enzimas con residuos hidrófobos tales como ácidos grasos o polietilenglicol.

2. Recubrir la superficie de las enzimas con tensioactivos, tales como ésteres de ácidos grasos de poliol.

3. Poner en contacto las enzimas con soportes hidrófobos, típicamente polipropileno, que han sido pretratados con disolventes hidrófilos, tales como etanol o isopropanol.

4. Añadir activadores enzimáticos, tales como disolución salina, glicerol, etc. a una baja concentración, típicamente por debajo del 1 %, al sistema de reacción.

Ninguno de los procedimientos mencionados anteriormente produjo unos resultados satisfactorios con respecto a la activación, la estabilización y la rentabilidad de las enzimas interfaciales inmovilizadas con objeto de llevar a cabo conversiones enzimáticas inversas en cantidades industriales. También se ha informado de que la mayoría de las enzimas, cuando son inmovilizadas según el procedimiento mencionado anteriormente, bien pierden una porción significativa de su actividad sintética, o bien no muestran el rendimiento completo de su actividad debido a ciertas limitaciones impuestas por el procedimiento de inmovilización. Por ejemplo, el recubrimiento de lipasas y de fosfolipasas con ésteres de ácidos grasos de poliol suponía un importante reto cuando las moléculas de lipasa no estaban completamente recubiertas con el activador; por lo tanto, aquellas moléculas de enzima que no estuvieran en contacto con el activador, permanecían inactivas.

El documento WO 00/75295 A1 describe enzimas lipolíticas que están modificadas químicamente mediante una unión covalente de uno o más grupos hidrófobos a la molécula de la enzima. El documento WO 99/15689 A1 describe un complejo de lipasa recubierto con un tensioactivo inmovilizado sobre una matriz insoluble.

Pavlenko I M y col. (Russian Journal of Bioorganic Chemistr y , Kluwer Academic Publishers-Plenum Publishers, NE, vol. 31, nº 6, 1 de noviembre de 2005 (2005-11-01) , páginas 535 -542) describe la hidrofobización de una lipasa mediante su modificación química con palmitato de N-succinidimilo.

El documento WO 99/33964 A1 describe un procedimiento para la producción de una preparación enzimática inmovilizada para su uso en un medio fundamentalmente orgánico desprovisto de agua libre que comprende un lecho fluido.

Otro importante inconveniente de las lipasas y de las fosfolipasas es su baja tolerancia frente a sustratos hidrófilos, particularmente alcoholes de cadena corta y ácidos grasos de cadena corta (por debajo de C4) . Se ha observado en muchos estudios de investigación que los alcoholes de cadena corta y los ácidos grasos de cadena corta, tales como metanol y ácido acético, son responsables del desprendimiento de moléculas de agua esenciales desde la estructura cuaternaria de estas enzimas, dando lugar a su desnaturalización y a la consecuente pérdida de su actividad catalítica. Este inconveniente ha prohibido la aplicación de las lipasas para la producción... [Seguir leyendo]

1. Una enzima interfacial modificada inmovilizada sobre un soporte sólido hidrófobo, en la que la enzima es una lipasa, una esterasa o una fosfolipasa y en la que dicha enzima está recubierta con grupos lipídicos unidos covalentemente, estando así rodeada por un microentorno hidrófobo y protegida de la desactivación y/o de la agregación en presencia de agentes, sustratos y/o productos de reacción hidrófilos, en la que dicho recubrimiento con grupos lipídicos se consigue mediante la unión covalente de epóxidos lipídicos a los grupos funcionales de la superficie de la enzima a través de su grupo epoxi original.

2. La enzima interfacial modificada de la reivindicación 1, en la que dicho soporte es capaz de unir dicha enzima mediante adsorción o mediante la unión covalente a grupos funcionales, y es un soporte poroso basado en polímeros hidrófobos, en el que dicho soporte contiene grupos funcionales activos, siendo uno cualquiera de grupos epoxi, aldehído y grupos iónicos.

3. La enzima interfacial modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en la que dicho lípido está seleccionado de entre ácidos grasos, ésteres alquílicos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos de azúcar, glucósidos alquílicos de cadena media y larga, fosfolípidos y derivados de polietilenglicol.

4. La enzima interfacial modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho soporte es un soporte basado en un polímero hidrófobo seleccionado de entre el grupo que consiste en polímeros reticulados hidrófobos alifáticos y acrílicos, o polímeros reticulados hidrófobos aromáticos.

5. La enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en la que dicha enzima deriva del grupo que consiste en Candida antarctica, Candida rugosa, Rhizomucor miehei, Pseudomonas sp., Rhizopus niueus, Mucor miehei, Mucor javanicus, Rhizopus or y zae, Aspergillus niger, Penicillium camembertii, Alcaligenes sp., Burkholderia sp., Thermomyces lanuginosa, Chromobacterium uiscosum, semillas de papaya y pancreatina.

6. Un procedimiento para la preparación de una enzima interfacial modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un sistema formado por una disolución tamponante acuosa y al menos un disolvente orgánico que contiene un epóxido lipídico;

(b) mezclar dicha enzima interfacial con el sistema bisolvente proporcionado en la etapa (a) ;

(c) añadir dicho soporte a la mezcla de la etapa (b) y mezclar;

(d) aislar de la mezcla obtenida en la etapa (c) la enzima interfacial inmovilizada sobre dicho soporte.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicho soporte es un soporte basado en un polímero hidrófobo, y en el que dicho soporte puede contener opcionalmente grupos funcionales activos, tales como grupos epoxi o aldehído, o grupos iónicos.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7, en el que dicho epóxido lipídico está seleccionado de entre ácidos grasos, ésteres metílicos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos de azúcar, glucósidos alquílicos de cadena media y larga, fosfolípidos y derivados de polietilenglicol.

9. Un procedimiento de preparación de ésteres metílicos de ácidos grasos (biodiésel) que comprenden la etapa de: la adición poco a poco de metanol a un aceite de una planta, de un animal, de un alga o de pescado, o a una mezcla de al menos dos de estos aceites que contiene una lipasa según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o preparada mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, y permitir que la reacción avance en unas condiciones adecuadas hasta que dichos triglicéridos de aceite se conviertan en ésteres metílicos de ácidos grasos.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho aceite vegetal es de semilla de soja, de canola, de colza, de oliva, aceite de palma, aceite de girasol, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de desecho de cocina o cualquier aceite de triglicérido derivado de fuentes vegetales no comestibles.