Entrega in vivo de ARN bicatenario a una célula objetivo.

Un ácido nucleico o vector de expresión para usar en el tratamiento o prevención de una enfermedad que involucra el hígado o para el tratamiento o prevención de una afección que involucra el hígado mediante la entrega de un ácido nucleico o vector de expresión a una célula del hígado en un animal en donde la entrega comprende:

transfectar al menos una célula de la piel o del músculo en dicho animal con el ácido nucleico o vector de expresión, en donde dicha transfección resulta en que dicho ácido nucleico o vector de expresión se entrega a al menos una célula en el hígado.

Entrega in vivo de ARN bicatenario a una celula objetivo.

Campo de la invencion La invencion se relaciona con metodos para la inhibicion de polinucleotidos objetivo mediada por ARN en celulas de mamifero. Estos incluyen ARNip, ARNhc, miARN, acidos nucleicos antisentidos, y ribozimas que se expresan endogenamente, asi como moleculas de ARNip, ARNhc, miARN, acidos nucleicos antisentidos y ribozima sinteticos que se expresan endogenamente. Los metodos se aplican ademas para proporcionar ARN funcional que incluye ARNm para indicaciones en terapia genica . Mas particularmente, se relaciona con metodos para inhibir la funcion de un polinucleotido objetivo en una celula de mamifero objetivo in vivo que comprende introducir en la primera celula tal como, una celula de la piel, celulas de tejido muscular, que incluyen celulas del musculo esqueletico o estriado (miocito o mioblasto) , o cualquier otra celula competente ARN bicatenario (ARNbc) del mamifero o constructo de expresion del polinucleotido que codifica uno o mas agente (s) ARNbc o iARN que incluyen ARNip, ARNhc, miARN u otros ARNbc, de manera que el agente iARN se entrega distalmente a la celula objetivo.

Antecedentes de la invencion La capacidad del ARN bicatenario para silenciar eficazmente la expresion genica, un fenomeno que se conoce ahora comunmente como interferencia por ARN (iARN) , ha sido uno de los mayores hallazgos cientificos de la pasada decada. Recientemente, los cientificos Andrew Fire y Craig Mello fueron galardonados con el Premio Nobel de Medicina 2006 por su trabajo pionero en el campo de iARN. Sin embargo, quedan aun muchos retos para mover el iARN del laboratorio a la clinica. El mayor reto de la inhibicion de la expresion genica objetivo mediada por iARN en animales y particularmente en humanos es la entrega eficiente del agente iARN a un numero suficiente de celulas objetivo. Una variedad de mecanismos de entrega se estan explorando actualmente en el campo del iARN. Por ejemplo, una serie de grupos demostraron exito y entrega eficiente de ARN bicatenario (bc) al higado de raton por inyeccion en la vena de la cola. McCaffrey y otros (Nature Biotechnol. (2003) 21 (6) : 639-44) reportaron inhibir la produccion de intermedios replicativos del virus de la hepatitis B en ratones despues de la inyeccion en la vena de la cola de plasmidos que expresan ARN de horquilla pequena especificos del HBV (ARNhc) . Giladi y otros (Mol. Therapy (2003) 8 (5) : 769-76) ademas reportan la inhibicion de la replicacion de HBV en ratones despues de la inyeccion en la vena de la cola del ARN interferente pequeno especifico del HBV (ARNip) , y Song y otros (Nature Med. (2003) 9 (3) : 347-51) reportan la interferencia por ARN de hepatitis fulminante en ratones despues de la inyeccion en la vena de la cola de ARNip especifico para el gen fas. Aunque la inyeccion en la vena de la cola es adecuada para inhibir en los ratones la expresion genica, no es una tecnica clinicamente relevante que se puede usar en los humanos. Sin embargo, diversos grupos han demostrado tambien la entrega exitosa de agentes terapeuticos del ARNbc sin la inyeccion en la vena de la cola usando los ARNbc sinteticos con estabilidad mejorada por administracion sistemica. Ver Soutschek y otros Nature (2004) 432 (7014) : 173-8; ver ademas Morrissey y otros Hepatol. (2005) 41 (6) : 1349-56. La administracion local en el higado se demostro ademas inyectando el ARN bicatenario directamente en el sistema circulatorio que rodea el higado usando la cateterizacion de la vena renal. Ver Hamar y otros PNAS (2004) 101 (41) : 14883-8. Tambien otros reportaron una entrega exitosa de ARNbc y particularmente ARNip usando complejos cationicos o formulaciones liposomales. Ver, por ejemp/o, Landen y otros Cancer Biol. Ther. (2006) 5 (12) ; ver ademas Khour y y otros Arthritis Rheumatol. (2006) 54 (6) : 1867-77. Ademas de la inyeccion en el sistema circulatorio y medios a base de lipidos para la entrega de ARN bicatenario, diversos grupos han reportado el uso de vectores retrovirales y adenovirales para la introduccion de ARNbc en mamiferos. Por ejemplo, Van den Haute y otros (Human Gene Therapy (2003) 14: 1799-1807) reportaron la entrega del vector lentiviral de horquilla pequena (ARNhc) contra la GFP reportera mejorada (EGFP) que mostraron reducir la expresion genica de la EGFP en el cerebro de raton hasta seis meses despues de la transduccion. McCaffrey y otros (Resumen num. 039, Keystone Symposia on siRNAs and miRNAs, Abril 14-19, 2004) reportaron la infusion intravenosa de adenovirus recombinantes que expresan ARNhc especificos del HBV en ratones infectados con HBV como una posible aproximacion contra la infeccion por el virus de la hepatitis en animales. De este modo, aunque algunos exitos se han demostrado usando la entrega localizada, o mediante el uso de la administracion sistemica del ARNbc estabilizado o complejo, existe todavia una gran necesidad de mecanismos de entrega de iARN in vivo que no requieren de formulaciones especializadas o procedimientos de entrega invasivos. Ademas, los presentes inventores demostraron que la entrega de ARNbc endogeno a base de ADN es especialmente ventajosa en que permite evitar la respuesta de interferon/PKR al proporcionar un suministro prolongado de ARNbc expresados, ver US 2004/0152117. En consecuencia, existe una necesidad en particular de mecanismos de entrega especificos de vectores de expresion de iARN a base de ADN que no requieren el uso de virus. La interferencia por ARN se descubrio primero en el nematodo C. e/eganspor los premios Nobel laureados Andrew Fire y Craig Mello y sus colegas, ver patente de los Estados Unidos 6, 506, 559. En la patente US '559, Fire y Mello y otros reportan la inhibicion mediada por ARNbc mostro una sorprendente capacidad para cruzar los limites celulares. Esta observacion ya se describio como un fenomeno que es particular de los nematodos o invertebrados, y generalmente los modos correspondientes de dicho trafico de iARN en organismos vertebrados se han diseminado.

Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente, sin embargo, que la entrega de constructos de expresion que codifican ARN bicatenarios por via intramuscular, subcutanea e intradermica resulta en la inhibicion especifica de la expresion genica in vivo en el higado y potencialmente otros organos y tejidos de los organismos de mamiferos. Sin deseos de estar limitado por ninguna teoria, los inventores postulan que la entrega de ARNbc al higado del musculo o la piel, por ejemplo, puede estar mediado por vesiculas extracelulares (exovesiculas) que contienen las moleculas de ARN expresadas tales como ARNbc, antisentido, miARN, o ARNm o moleculas de ARN inyectadas/introducidas tales como ARNip, ARNhc, etc. que brotan de la superficie de las celulas del musculo transfectadas. La extrusion de dichas exovesiculas se ha mostrado por diversos tipos de celulas incluyendo el musculo.

Existe evidencia en la tecnica de que ciertas lectinas se exportan de las celulas del musculo y mioblastos a traves de evaginaciones de la membrana celular que se estrangulan para formar vesiculas extracelulares llamadas exovesiculas. Dichas lectinas que incluyen, las beta galectinas se conocen por estar en la superficie de las exovesiculas extrudidas. Ver Cooper y Barondes, Evidence of export of a muscle lectin from cytosol to extracellular matrix and for a novel secretor y mechanism. J. Cell Sci. (1990) 110: 1681-91; ver ademas Harrison y Wilson, The 14 kDa beta-galactoside binding lectin in myoblast and myotube cultures: localization by confocal microscopy, J. Cell Sci. (1992) 101 (Pt. 3) : 635

46. Las vesiculas extracelulares se han observado ademas en la periferia de los fibroblastos, que estan presentes en grandes cantidades en la capa dermica de la piel. Ver Mehul y Hughes, 1997, Plasma membrane targeting, vesicular budding, and release of galectin 3 from the cytoplasm of mammalian cells during secretion, J. Cell Sci. 110: 1169-78. Existe ademas evidencia que las lectinas y ciertas glicoproteinas pueden aclararse a partir de la circulacion por receptores especificos en la superficie de las celulas del higado. Ver, por ejemp/o, Park y otros, The asialoglycoprotein receptor clears glycoconjugates terminating with sialic acid alpha 2, 6GaINAc. PNAS (2005) 102 (47) : 17125-9; ver ademas Nagaoka y otros. Los receptores de galectina se conocen para expresarse en la superficie de los hepatocitos. Ademas, los receptores de betagalectina han demostrado que se expresan de una manera polarizada en el lateral sinusoidal de los hepatocitos, "A quantitative analysis of lectin binding to adult rat hepatocytes cell surfaces", In Vitro Cellular and Developmental Biology (1988) 24: 401-412; "Participation of a galectin-dependent mechanism in the hepatic clearance of tissue-type plasminogen activator and plasma kallikrein." Thromb Res (2003) 108: 257-262. Prud'homme y otros describen... [Seguir leyendo]

1. Un acido nucleico o vector de expresion para usar en el tratamiento o prevencion de una enfermedad que involucra el higado o para el tratamiento o prevencion de una afeccion que involucra el higado mediante la entrega de un acido nucleico o vector de expresion a una celula del higado en un animal en donde la entrega comprende:

transfectar al menos una celula de la piel o del musculo en dicho animal con el acido nucleico o vector de expresion, en donde dicha transfeccion resulta en que dicho acido nucleico o vector de expresion se entrega a al menos una celula en el higado.

2. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicha transfeccion de al menos una celula del musculo o al menos una celula de la piel resulta en dicho acido nucleico o vector de expresion que se encapsula mediante al menos una exovesicula de la celula del musculo

o de la celula de la piel, y en donde al menos una de dicha exovesicula se entrega a al menos una celula en el higado.

3. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde al menos una de dicha celula del musculo o de la piel se transfecta ex vivo con dicho acido nucleico o vector de expresion, y en donde dicha celula del musculo o de la piel transfectada se introduce en un animal en donde dicha introduccion resulta en dicho acido nucleico o vector de expresion que se entrega a al menos una celula de higado.

4. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde dicha transfeccion de al menos una celula del musculo o de al menos una celula de la piel resultando en dicho acido nucleico o vector de expresion que se encapsula mediante al menos una exovesicula se realiza in vitro o ex vivo, y en donde al menos una de dicha exovesicula se aisla y administra a un animal tal que dicho acido nucleico o vector de expresion se entrega a al menos una celula de higado.

5. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde al menos una celula del musculo o al menos una celula de la piel se selecciona del grupo que consiste de las celulas en la capa dermica de la piel, las celulas en la capa subcutanea de la piel, miocitos, y mioblastos.

6. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en donde el acido nucleico es acido ribonucleico (ARN) o un ARN modificado o el vector de expresion contiene un acido nucleico que codifica un ARN.

7. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 6 en donde el ARN se selecciona del grupo que consiste de ARN antisentido, ARN micro (miARN) , ARN mensajero (ARNm) , ARNip, ARNhc, ARN modificado quimicamente, ARN de ribozima, ARNbc de horquilla, ARN micro que forma ARN triple, un ligando ARN de alta afinidad seleccionado artificialmente (aptomero) y ARNbc.

8. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, en donde una hebra de dicho ARNbc es sustancialmente complementaria a una region de un gen objetivo en el higado, y en donde la entrega de dicho ARNbc o dicho acido nucleico que codifica dicho ARNbc a la celula de higado inhibe

o reduce la expresion de dicho gen objetivo.

9. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde dicha region se selecciona del grupo que consiste de una region transcrita del gen objetivo, una region promotora del gen, y una region del gen sin traducir corriente arriba o corriente abajo.

10. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9, en donde dicho gen objetivo se selecciona del grupo que consiste de un gen patogeno, un gen viral, y un gen endogeno.

11. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde dicho gen viral es un gel viral de la Hepatitis seleccionado del grupo que consiste de Hepatitis A (HAV) , Hepatitis B (HBV) , Hepatitis C (HCV) , Hepatitis D (HDV) y Hepatitis E (HEV) .

12. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde dicho gen endogeno se selecciona del grupo que consiste de un gen de apolipoproteina (APOB) , un gen pcsk 9, y un gen A1AT.

13. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12 en donde el acido nucleico o vector de expresion se transfecta en las celulas del musculo o de la piel junto con un agente que facilita la transfeccion.

14. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 13 en donde el agente que facilita la transfeccion es bupivacaina o la electroporacion.

15. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde dichas celulas transfectadas expresan un ligando de superficie o transmembrana especifico para un receptor en la celula del higado.

16. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 15, en donde un acido nucleico que expresa dicho ligando de superficie o transmembrana se co-transfecta con dicho acido nucleico o vector de expresion.

17. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho acido nucleico es ARNbc que tiene de 15 a 50 pares de bases.

18. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 17 en donde el ARNbc es un ARNhc, miARN o un ARNip.

19. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde el animal es un mamifero.

20. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con la reivindicacion 19 en donde el mamifero es un humano.

21. El acido nucleico o vector de expresion para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-20 en donde la enfermedad o afeccion de o que involucra el higado es:

(a) una enfermedad viral del higado;

(b) cancer del higado;

(c) una enfermedad genetica del higado;

(d) una afeccion que se puede modular dirigiendo un ARN o gen en el higado;o

(e) terapia genica en el higado donde se sustituye un ARNm funcional.

22. El uso de un acido nucleico o vector de expresion en la fabricacion de un medicamento para entregar un acido nucleico o vector de expresion a una celula de higado en un animal en donde la entrega comprende:

transfectar al menos una celula de la piel o del musculo en dicho animal con el acido nucleico o vector de expresion, en donde dicha transfeccion resulta en que dicho acido nucleico o vector de expresion se entrega a al menos una celula en el higado.

23. El uso del acido nucleico o vector de expresion de acuerdo con la reivindicacion 22, en donde el acido nucleico es el acido ribonucleico (ARN) o un ARN modificado o vector de expresion que contiene un acido nucleico que codifica un ARN.

24. El uso del acido nucleico o vector de expresion de acuerdo con la reivindicacion 23, en donde el ARN se selecciona del grupo que consiste de ARN antisentido, ARN micro (miARN) , ARN mensajero (ARNm) , ARNip, ARNhc, ARN modificado quimicamente, ARN de ribozima, ARNbc de horquilla, ARN micro que forma ARN triple, un ligando ARN de alta afinidad seleccionado artificialmente (aptomero) y ARNbc.

25. El uso del acido nucleico o vector de expresion de la reivindicacion 23 o 24, en donde una hebra de dicho ARNbc es sustancialmente complementaria a una region del gen objetivo en el higado, y en donde la entrega de dicho ARNbc o dicho acido nucleico que codifica dicho ARNbc a la celula del higado inhibe o reduce la expresion de dicho gen objetivo.

26. Uso de un acido nucleico o vector de expresion de la reivindicacion 25, en donde dicho gen objetivo se selecciona del grupo que consiste de un gen patogeno, un gen viral, y un gen endogeno.

Figurd4 sChenºCdifuº MetodoºABI: ºNunlein ºAnidºResedrnh, º2005, 33s20º:e179º