Ensayo de diagnóstico de infección por Mycobacterium tuberculosis.

Un método para aumentar la sensibilidad de un ensayo de diagnóstico para diagnosticar infección porMycobacterium tuberculosis en un ser humano,

donde dicho ensayo de diagnóstico comprende poner en contactocélulas T de dicho ser humano con un antígeno de Mycobacterium tuberculosis que no es Rv3879c y determinar sialguna de dichas células T reconoce dicho antígeno; comprendiendo adicionalmente dicho método(i) poner en contacto células T de dicho ser humano con uno o más de

(a) un péptido que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1 o al menos un 80% dehomología con la SEC ID Nº 1;

(b) una combinación de péptidos que tiene o comprende cada uno la secuencia de al menos 8aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1; o

(c) una combinación de péptidos que tiene cada uno al menos un 80% de homología con unasecuencia de al menos 8 aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº 1; y

(ii) determinar si alguna de dichas células T reconoce dicho péptido,

donde el método se realiza in vitro, y donde está presente una célula presentadora de antígeno (APC).

Ensayo de diagnóstico de infección por Mycobacterium tuberculosis

Campo de la invención La invención se refiere a un método para aumentar la sensibilidad de un ensayo de diagnóstico para infección por Mycobacterium tuberculosis en un ser humano.

Antecedentes de la invención El diagnóstico preciso de infección por tuberculosis es esencial para el tratamiento, prevención y control de esta enfermedad resurgente. Como a menudo es difícil cultivar Mycobacterium tuberculosis (MTB) de pacientes con TB activa, e imposible cultivarla de personas sanas infectadas de forma latente, sería muy útil un ensayo de diagnóstico de base inmune que indique la presencia o ausencia de infección por MTB para el diagnóstico de TB activa y exploración de infección latente por MTB.

El único ensayo ampliamente usado es el ensayo cutáneo de tuberculina (TST) de un siglo de antigüedad o el ensayo de Mantoux que se basa en la detección de una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) contra una administración intradérmica de un Derivado de Proteína Purificada de la micobacteria. Este ensayo tiene muchos inconvenientes entre estos el principal es su mala especificidad resultante de la amplia reactividad cruzada antigénica del derivado de proteína purificada (PPD) , una mezcla en bruto de más de doscientas proteínas de MTB ampliamente compartidas entre MTB, el bacilo de Calmette-Guerin (BCG) de M. bovis y la mayoría de las micobacterias del entorno. Por tanto, son habituales resultados falsos positivos en personas con exposición a micobacterias del entorno y vacunación previa con BCG. Esto presenta un problema significativo porque la mayoría de la población mundial está vacunada con BCG y el efecto confuso de BCG persiste durante hasta 15 años después de la vacunación.

La genómica comparativa ha identificado varias regiones genéticas en MTB y M. bovis que se delecionan en BCG de M. bovis. Se han identificado varias regiones de diferencia, denominadas RD1 -RD16, entre MTB o M. bovis y BCG. Todas representan partes del genoma de M. bovis delecionadas durante cultivo prolongado in vitro. RD1 se delecionó antes de 1921, cuando se diseminó por primera vez BCG de forma internacional para su uso como vacuna. RD1 por tanto está ausente de todas las cepas de vacuna de BCG, así como la mayoría de las micobacterias del entorno, pero aún está presente en el complejo Mycobacterium tuberculosis, incluyendo todos los aislados clínicos de MTB y M. bovis. Existen nueve fases de lectura abierta (ORF) en la región génica RD1. La diana antigénica secretora temprana-6 (ESAT-6) y la proteína de filtrado de cultivo 10 (CFP10) están codificadas en RD1 y se han investigado intensivamente en modelos animales y seres humanos durante los últimos años pasados. ESAT6 y CFP10 son fuertes dianas de la respuesta inmune celular en modelos animales, pueden usarse pacientes de tuberculosis y contactos y similares en nuevos ensayos sanguíneos basados en células T específicos que no reaccionan de forma cruzada con BCG.

Las respuestas inmunes celulares contra los productos génicos de RD1, RD2 y RD14 se han investigado recientemente en ganado bovino infectado con M. bovis y vacunado con BCG. Ocho antígenos parecen ser potentes antígenos de células T, Rv1983, Rv1986, Rv3872, Rv3873, Rv3878, Rv3879c, Rv1979c, y Rv1769) (Cockle et al.,

2002, Infect. Immun. 70:6996-7003) .

Sin embargo, no es posible predecir en base a los antígenos que son antígenos de células T en ganado bovino cuáles serán los antígenos de células T en seres humanos. Así como otras diferencias en el procesamiento de antígenos, la presentación y el reconocimiento, el ganado bovino tiene diferentes moléculas MHC que los seres humanos, y por tanto se espera que reconozcan diferentes antígenos.

Sumario de la invención Los presentes inventores han identificado Rv3879c como antígeno principal de células T en seres humanos,

respondiendo un 45% de los pacientes con tuberculosis a péptidos del producto génico de Rv3879. Solamente uno de 38 (2, 6%) donantes vacunados con BCG respondió a péptidos de Rv3879c. La alta especificidad de los péptidos Rv3879c, junto con su moderada sensibilidad en pacientes con tuberculosis, identifica a estos péptidos como candidatos para su inclusión en nuevos ensayos basados en células T para infección por MTB.

De forma crucial, los inventores identificaron 3 individuos (de los 49 pacientes de TB confirmados por cultivo) que respondieron a péptidos Rv3879c y que no respondieron a ninguno de los 35 péptidos solapantes de 15 monómeros que abarcan la longitud de ESAT-6 y CFP10 (que se sabe que son antígenos MTB inmunodominantes de utilidad diagnóstica) . Este resultado muestra que péptidos Rv3879c pueden usarse para aumentar la sensibilidad de diagnóstico que usen péptidos ESAT-6 y CFP10. Este aumento en la sensibilidad (que fue del 6% en el presente 65 estudio de 49 pacientes con TB) es clínicamente muy importante. Una sensibilidad muy elevada permite a los doctores descartar la posibilidad de tuberculosis cuando un ensayo de diagnóstico es negativo. En particular, los ensayos de diagnóstico de base inmune (incluyendo el ensayo cutáneo in vivo) pueden dar resultados falsos negativos en individuos inmunosuprimidos a causa de su limitada sensibilidad. Una mayor sensibilidad de diagnóstico permitirá a los doctores detectar de forma precisa infección por TB incluso en estos pacientes inmunosuprimidos vulnerables que están en mayor riesgo de tuberculosis severa y diseminada.

Por consiguiente, la invención proporciona un método para aumentar la sensibilidad de un ensayo de diagnóstico para diagnosticar infección por Mycobacterium tuberculosis en un ser humano, donde dicho ensayo de diagnóstico comprende poner en contacto células T de dicho ser humano con un antígeno de Mycobacterium tuberculosis que no es Rv3879c y determinar si alguna de dichas células T reconoce dicho antígeno, comprendiendo adicionalmente dicho método:

(i) poner en contacto células T de dicho ser humano con uno o más de (a) un péptido que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1 o al menos un 80% de homología con la 15 SEC ID Nº 1;

(b) una combinación de péptidos que tienen o comprenden cada uno la secuencia de al menos 8 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1; o

(c) una combinación de péptidos que tiene cada uno al menos un 80% de homología con una secuencia de al menos 8 aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº 1; y

(ii) determinar si alguna de dichas células T reconoce dicho péptido, donde el método se realiza in vitro, y donde está presente una célula presentadora de antígeno (APC) . 25

Breve descripción de las Figuras La Figura 1 muestra la proporción de pacientes con TB confirmada por cultivo (n=49) y vacunados con BCG sanos no expuestos (n=38) que responden en IFN-!-ELISPOT contra combinaciones de péptidos de los cuatro productos génicos de la región RD. Se ensayaron las PBMC de cada participante usando el ensayo IFN-!-ELISPOT con combinaciones de péptidos entre 5 y 7 péptidos que representan diferentes antígenos de RD1 (Rv3873, Rv3878, Rv3879c) y RD2 (Rv1989c) .

A: Porcentaje de pacientes con TB confirmada por cultivo y vacunados con BCG no expuestos que 35 respondían a cada combinación de péptidos en IFN-!-ELISPOT.

B: Porcentaje de pacientes con TB confirmada por cultivo y vacunados con BCG no expuestos que respondieron a una o más combinaciones de péptidos de cada uno de los productos génicos RD1 y RD2. La columna más a la derecha muestra el porcentaje de donantes que respondieron a una o más de cualquiera de las 11 combinaciones de péptidos de los 4 antígenos. Las columnas rellenas muestran las tasas de respuesta en pacientes con TB, y las columnas sombreadas muestran las tasas de respuesta en donantes vacunados con BCG no expuestos.

La Figura 2 muestra magnitud de las respuestas en IFN-!-ELISPOT a antígenos de la región RD en 49 pacientes con TB confirmada por cultivo (A) y 38 vacunados con BCG sanos no expuestos (B) . Las frecuencias de células 45 formadoras de manchas (SFC) que secretan IFN-! específico de péptido se sumaron para cada una de las combinaciones de péptidos constituyentes para cada antígeno, se enumeraron por ensayo ELISPOT ex vivo en pacientes con TB (A) , y donantes vacunados con BCG sanos no expuestos (B) . Las barras horizontales representan la respuesta media para cada antígeno. Los puntos en la línea basal representan individuos sin respuesta a un antígeno dado (es decir, menos de 5 SFC por encima del control negativo para cada uno de los péptidos constituyentes de cada combinación del antígeno dado) . La línea horizontal discontinua... [Seguir leyendo]

1. Un método para aumentar la sensibilidad de un ensayo de diagnóstico para diagnosticar infección por Mycobacterium tuberculosis en un ser humano, donde dicho ensayo de diagnóstico comprende poner en contacto células T de dicho ser humano con un antígeno de Mycobacterium tuberculosis que no es Rv3879c y determinar si alguna de dichas células T reconoce dicho antígeno; comprendiendo adicionalmente dicho método (i) poner en contacto células T de dicho ser humano con uno o más de (a) un péptido que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1 o al menos un 80% de homología con la SEC ID Nº 1;

(b) una combinación de péptidos que tiene o comprende cada uno la secuencia de al menos 8 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1; o (c) una combinación de péptidos que tiene cada uno al menos un 80% de homología con una 15 secuencia de al menos 8 aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº 1; y

(ii) determinar si alguna de dichas células T reconoce dicho péptido,

donde el método se realiza in vitro, y donde está presente una célula presentadora de antígeno (APC) . 20

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la etapa (i) comprende adicionalmente poner en contacto dichas células T con uno o más antígenos de células T adicionales de Mycobacterium tuberculosis o con uno o más análogos de dicho antígeno o antígenos que son capaces de unirse a un receptor de células T que reconoce dicho antígeno o antígenos.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho uno o más antígeno de células T adicionales incluyen antígenos codificados por la región RD-1 o RD-2, siendo dichos antígenos preferiblemente ESAT-6 y/o CFP10; o fragmentos de los que son de al menos 8 aminoácidos de longitud.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, donde dicho uno o más antígenos de células T adicionales que no son Rv3879c se seleccionan entre Rv3873, Rv3878 o Rv1989c; o fragmentos de los mismos que son de al menos 8 aminoácidos de longitud.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la etapa (i) comprende poner en contacto dicha muestra de células T con dos o más péptidos diferentes, teniendo cada uno la secuencia de al menos 8 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1, y/o donde se ponen en contacto péptidos de, o análogos de, al menos cinco antígenos diferentes con las células T.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde uno o más de los péptidos 40

(i) están representados por las SEC ID Nº 2 a 18, o

(ii) que se unen a una célula T que reconoce (i) , se ponen en contacto con las células T, y/o

donde el reconocimiento de dicho péptido por dichas células T se determina detectando la secreción de una 45 citoquina desde las células T.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, donde la citoquina es IFN-!.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, donde dicha citoquina se detecta permitiendo que dicha

citoquina se una a un anticuerpo inmovilizado específico para dicha citoquina y detectando la presencia del complejo anticuerpo/citoquina.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dichas células T son células ex vivo recién aisladas. 55

Figura 1

A.

% de sujetos con respuesta positiva

Combinación 1 combinación 2 combinación 3 combinación 1 combinación 2 Combinación 1 combinación 2 combinación 3 Combinación 1 combinación 2 combinación 3

Combinaciones de péptidos B.

Figura 2

A.

B. Figura 3.