Procedimiento para eliminar partículas no espermáticas en una muestra de semen obtenida de un animal.

Procedimiento para eliminar partículas no espermáticas en una muestra de semen obtenida de un animal en el que se realiza un análisis de la estructura de la cromatina espermática por citometría de flujo,

donde dicho análisis comprende la desnaturalización ácida del ADN y posterior tinción con naranja de acridina del ADN, que comprende: excitar dicha muestra con un láser que emite luz de longitud de onda entre 400 y 535 nm, detectar la fluorescencia verde y naranja emitida por la muestra con dos fotodetectores, utilizar los valores de fluorescencia verde y naranja para discriminar partículas espermáticas de partículas no espermáticas y eliminar las partículas no espermáticas del análisis. Dicho animal puede ser un mamífero, por ejemplo, oveja, cerdo, cabra, vaca, caballo y humano.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a un procedimiento para discriminar y eliminar partículas contaminantes en el análisis de la cromatina espermática mediante tinción con naranja de acridina y citometría de flujo.

El procedimiento de la invención es aplicable en los sectores o actividades relacionadas con el uso y análisis de espermatozoides, especialmente en el campo de la andrología y de las tecnologías de reproducción asistida ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La citometría de flujo es una tecnología basada en la utilización de un haz láser para el análisis de células suspendidas en un fluido, el cual arrastra las células, exponiéndolas brevemente al haz láser. Una serie de fotodetectores recoge la luz dispersada o emitida por las células, permitiendo su clasificación en función de distintos factores. Generalmente, las células son previamente marcadas con compuestos fluorescentes o con moléculas marcadoras (e.g., anticuerpos) que tienen asociados marcadores fluorescentes.

Esta tecnología ha cobrado una gran importancia en andrología. Se han desarrollado numerosas técnicas para el análisis mediante citometría de flujo de espermatozoides humanos y de otros animales, tanto domésticos como silvestres, utilizándose para estimar la concentración espermática, la viabilidad, la funcionalidad de distintos orgánulos o la integridad de la cromatina espermática. Aunque gran parte del uso está orientado a la investigación, algunas clínicas y centros de cría animal disponen ya de citómetros de flujo para la realización rutinaria de estos análisis. Hay que destacar la utilización de esta técnica en el sexaje de semen, utilizada sobre todo en ganado bovino.

Una de las técnicas más establecidas en el análisis de la calidad espermática es el análisis de la estructura de la cromatina espermática mediante citometría de flujo (SCSA®, Sperm Chromatin Structure Assay) . Los espermatozoides se someten a un paso de desnaturalización ácida del ADN , seguido por la tinción con el fluorocromo naranja de acridina, un agente metacromático intercalante en el ADN. El naranja de acridina es excitado con luz cyan (máxima a 502 nm) y emite fluorescencia verde cuando se intercala en AON de doble hélice (máxima a 525 nm) , y fluorescencia roja si se intercala en ADN de hélice sencilla (máxima a 640 nm) . Dado que el ADN de hélice sencilla se presenta en zonas propensas a la desnaturalización, que coincidirían con roturas de la hebra o con otras alteraciones de la cromatina, se calcula un índice de fragmentación del ADN (DFI) como la relación entre la fluorescencia roja del núcleo y la fluorescencia tolal. Esta técnica es posiblemente la más estandarizada y que ha sido objeto de más estudios en relación con la fertilidad tanto clínica como en campo. Por otra parte, las características de excitación y emisión del naranja de acridina lo hacen propicio para el análisis en la mayor parte de los citómetros de flujo, ya que el equipamiento estándar incluye un láser operando a 488 nm y dos fotodetectores con filtros para detectar luz de color verde (en torno a 530 nm) y roja (por encima de 620 nm ) .

En el análisis de espermatozoides mediante SCSA®, uno de los problemas que se plantean es la presencia de partículas no espermáticas (debris) o de agregados de células. Este problema aparece en cualquier técnica basada en la citometría de flujo, y se han propuesto diversas metodologías orientadas a o que incluyen métodos para eliminar estas partículas indeseables durante o después del análisis. En el caso del SCSA®, Evenson y Jost (Sperm chromatin structure assay is useful for fertility assessment, Methods Cell. Sci., 2000, 22, 169--189) describen tres tipos de contaminantes (partículas con baja fluorescencia -que no se corresponden a células-, bacterias y agregados celulares) , y proponen la utilización del gating (filtrado mediante regiones dibujadas sobre las gráficas proporcionadas por el análisis) para eliminar estas partículas indeseables. Esta propuesta se basa en el hecho de que estas partículas forman poblaciones diferenciadas en el citograma rojo vs. verde, y generalmente suficientemente separadas de la población que corresponde a los espermatozoides.

Sin embargo, existen diversos tipos de muestras en las cuales aparecen numerosas partículas no espermáticas cuyo nivel de fluorescencia roja y verde coincide con el de algunas partículas espermáticas. La existencia de estas partículas no espermáticas cuyo nivel de fluorescencia roja y verde coincide con el de algunas partículas espermáticas constituye un problema técnico a resolver, y para el cual el procedimiento descrito por Evenson y Jost (2000) no ofrece una solución.

El procedimiento de la invención, descrito en las reivindicaciones, proporciona una solución a este problema técnico.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

Una realización es un procedimiento para eliminar partículas no espermáticas en una muestra de semen obtenida de un animal en el que se realiza un análisis de la estructura de la cromatina espermática por citometría de flujo, donde dicho análisis comprende la desnaturalización ácida del ADN y posterior tinción con naranja de acridina del ADN, donde dicho procedimiento comprende:

(a) excitar dicha muestra con un láser que emite luz de longitud de onda entre 400 y 535 nm,

(b) detectar la fluorescencia verde y naranja emitida por la muestra con dos fotodelectores ,

(e) utilizar los valores de fluorescencia verde y naranja para discriminar partículas espermáticas de partículas no espermáticas y eliminar las partículas no espermáticas del análisis, en adelante procedimiento de la invención.

En el procedimiento de la invención se realiza la eliminación de partículas no espermáticas de los análisis de SCSA®, en el caso en que estas solapen con alguna de las poblaciones de partículas espermáticas, de tal manera que su discriminación mediante gating sea difícil o imposible. En la presente invención se han encontrado diversos tipos de muestras en las cuales aparecen numerosas partículas no espermáticas cuyo nivel de fluorescencia roja y verde coincide con el de la población espermática caracterizada por tener un DFI incrementado. Estas partículas suelen formar una población en diagonal, más o menos compacta y a la derecha de la población principal (con DFI bajo) de espermatozoides. Por lo tanto, coincide en su posición o cruza el área en el que aparecerían al menos parte de los espermatozoides con DFI moderado o alto.

La presente invención se diferencia del procedimiento descrito por Evenson y Jost (2000) en la utilización de un tercer fotodetector, además de los dos propuestos por Evenson y Jost (2000) en la técnica (fotodetector de fluorescencia verde y fotodetector de fluorescencia roja) . Este fotodetector está configurado para recoger la fluorescencia amarillo-naranja (longitud de onda entre 550 y 620 nm) en modo linear. En la configuración del fotomultiplicador, el valor de voltaje se fija entre 200 y 700 Y el valor de ganancia entre 1 y 5.

Una vez realizado el análisis de las muestras, se dispone de los valores de fluorescencia naranja de cada partícula, además de los valores de fluorescencia verde y roja. En caso de que se presenten poblaciones de partículas no espermáticas que solapen con las poblaciones espermáticas (Figura 1) , y por tanto no se puedan eliminar utilizando la intensidad de la fluorescencia roja o verde o una relación entre ellas, éstas se pueden discriminar utilizando la información proporcionada por la intensidad de la fluorescencia naranja de cada partícula.

La fluorescencia naranja por si sola no permite discriminar entre partículas espermaticas y no espermaticas, ya que la intensidad de la fluorescencia de ambas poblaciones solapa. Un método sencillo para eliminar las partículas no espermáticas aprovechando los datos de fluorescencia naranja es la representación en un dtagrama de intensidad de fluorescencia verde vs. intensidad de fluorescencia naranja. En este tipo de citograma (Figura 2) , la población correspondiente al debris queda definida como una población paralela a la población espermática, siendo posible su eliminación manual o automatizada, aunque la proximidad entre ambas poblaciones requiere la revisión de las dos poblaciones muestra a muestra, y puede conllevar un alto nivel de falsos positivos o negativos.

Estas dos poblaciones pueden separarse de una manera más efectiva utilizando la relación entre las fluorescencias naranja y verde Por ejemplo, la relación naranja/verde o naranja/[naranja+verde] para cada partícula. Estas relaciones pueden representarse como citogramas verde vs. relación naranja/verde... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para eliminar partículas no espermáticas en una muestra de semen obtenida de un animal en el que se realiza un análisis de la estructura de la cromatina espermática por citometría de flujo, donde dicho análisis comprende la desnaturalización ácida del AON y posterior tinción con naranja de acridina del AON, caracterizado por que comprende:

(a) excitar dicha muestra con un láser que emite luz de longitud de onda entre 400 y 535 nm,

(b) detectar la fluorescencia verde y naranja emitida por la muestra con dos 10 fotodetectores,

(e) utilizar los valores de fluorescencia verde y naranja para discriminar partículas espermáticas de partículas no espermáticas y eliminar las partículas no espermáticas del análisis.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho animal es un 15 mamífero.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que dicho mamífero está seleccionado del grupo compuesto por oveja, cerdo, cabra, vaca, caballo y humano. 4 Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que en la etapa (b) dicha fluorescencia naranja se detecta con un fotodetector que recoge la 20 fluorescencia emitida entre 550 y 620 nm.

5. Procedimiento según cualquiera de reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que en la etapa (c) se utiliza la relación entre el valor de la fluorescencia naranja y la fluorescencia verde o la relación entre el valor de la fluorescencia naranja y la suma de los valores de fluorescencia naranja y fluorescencia verde.