Procedimiento para el diagnóstico y la monitorización de la enfermedad de Alzheimer.

Un procedimiento de ayuda en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer ("EA"),

que comprende compararun nivel medido de al menos un biomarcador de diagnóstico de la EA en una muestra de fluido biológicoperiférico de un individuo con un nivel de referencia para el biomarcador, en el que el biomarcador dediagnóstico de la EA es IGFBP-2 (proteína de unión al factor de crecimiento insulinoide 2), en el que dicho nivelde referencia comprende:

(a) un nivel promedio obtenido de una población que no padece la EA; o

(b) un nivel medio o de la mediana de un grupo de individuos incluyendo pacientes con EA;

y en el que dicha muestra de fluido biológico periférico es una muestra de sangre u orina.

Procedimiento para el diagnóstico y la monitorización de la enfermedad de Alzheimer

Antecedentes de la invención Se estima que 4, 5 millones de americanos tienen la enfermedad de Alzheimer ("EA") . En el año 2050, se estima que el intervalo de prevalencia de EA sea de 11, 3 millones a 16 millones. Actualmente, el coste social de la EA para los EE. UU. es de 100.000 millones de dólares por año, incluyendo 61.000 millones de dólares nacidos de empresas de los EE. UU. Ni Medicare ni el seguro médico más privado cubre el cuidado a largo plazo que la mayoría de los pacientes necesita.

La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa del sistema nervioso central asociada con la pérdida de memoria progresiva que da como resultado la demencia. Se observan dos características patológicas en los pacientes de EA en la autopsia: placas extracelulares y marañas intracelulares en el hipocampo, corteza cerebral, y otras áreas del cerebro esenciales para la función cognitiva. Las placas se forman mayormente del depósito de beta-amiloide ("Aβ") , un péptido derivado de la proteína precursora amiloide ("APP") . Las marañas filamentosas se forman de filamentos helicoidales apareados compuestos de neurofilamentos y proteína tau hiperfosforilada, una proteína asociada a microtúbulos. Sin embargo, no queda claro si estos dos cambios patológicos están asociados sólo con la enfermedad o si en verdad están implicados en el proceso degenerativo. La EA de inicio tardío/esporádica presenta una patología virtualmente idéntica a la EA heredada de inicio temprano/familiar (FAD) , lo que sugiere, por tanto, rutas patogénicas comunes para ambas formas de EA. Hasta la fecha, los estudios genéticos han identificado tres genes que provocan EA de inicio temprano, autosómica dominante la proteína precursora amiloide ("APP") , presenilina 1 ("PS1") , y presenilina 2 ("PS2") . Un cuarto gen, apolipoproteína E ("ApoE") , es el factor de riesgo genético más fuerte y más común para la EA, pero no necesariamente la provoca. Todas las mutaciones asociadas con las proteínas APP y PS pueden dar lugar a un incremento en la producción de péptidos Aβ, específicamente la forma más amiloidógena, Aβ42. Además de las influencias genéticas sobre la formación de placas amiloides y marañas intracelulares, los factores ambientales (por

ejemplo, citocinas, neurotoxinas, etc.) también pueden desempeñar un papel importante en el desarrollo y la progresión de la EA.

La característica clínica principal de la EA es un deterioro cognitivo progresivo que da lugar a una pérdida de memoria. La disfunción de memoria implica un impedimento para aprender nueva información que a menudo se caracteriza como una pérdida de memoria a corto plazo. En las fases temprana (leve) y moderada de la enfermedad,

puede parecer que se preserva un recuerdo de material bien aprendido, remoto, pero la nueva información no se puede incorporar adecuadamente en la memoria. La desorientación en el tiempo está estrechamente relacionada con la alteración de la memoria.

Las alteraciones en el lenguaje también son una parte prominente de la EA. A menudo se manifiestan, en primer lugar, como una dificultad para encontrar las palabras en el habla espontánea. A menudo, el lenguaje de los pacientes con EA es vago, carente de detalles y puede tener un incremento de frases automáticas y clichés. La dificultad para nombrar los objetos cotidianos a menudo es por deficiencias complejas prominentes en la función visual que están presentes en muchos pacientes con EA, ya que son deficiencias cognitivas focales tales como apraxia, acalculia y desorientación izquierda-derecha. Con frecuencia se observan alteraciones en el juicio y en la resolución de problemas.

En la EA también son comunes síntomas no cognitivos o de conducta y pueden representar una proporción incluso mayor de carga o estrés para el cuidador que la disfunción cognitiva. Comúnmente se informa de cambios en la personalidad y de variaciones de pasividad progresiva a agitación marcada. Los pacientes pueden presentar cambios tales como una disminución en las expresiones de afecto. Los síntomas depresivos están presentes hasta en un 40 %. También se ha reconocido una tasa de ansiedad similar. Se produce psicosis en un 25 %. En algunos 45 casos, los cambios en la personalidad pueden preceder a alteraciones cognitivas.

Actualmente, el procedimiento primario de diagnóstico de la EA en pacientes vivos implica obtener una historia clínica detallada del paciente, realizar pruebas de memoria y psicológicas, y descartar otras explicaciones para la pérdida de memoria, incluyendo trastornos temporales (por ejemplo, depresión o carencia de vitamina B12) o permanentes (por ejemplo, apoplejía) . Sin embargo, estos procedimientos de diagnóstico clínico no son infalibles.

Un obstáculo para el diagnóstico es establecer con exactitud el tipo de demencia; la EA sólo es una de las setenta afecciones que producen demencia. Debido a esto, la EA no se puede diagnosticar con completa precisión hasta después de la muerte, cuando la autopsia revela placas amiloides y marañas neurofibrilares características de la enfermedad en el cerebro del paciente. Además, los procedimientos de diagnóstico clínico sólo son útiles después de que los pacientes hayan comenzado a presentar pérdida de memoria o cambios en la personalidad anormales 55 significativos. Para entones, es probable que el paciente haya tenido EA durante años.

Dada la magnitud del problema para la salud pública planteado por la EA, se han emprendido considerables esfuerzos de investigación para aclarar la etiología de la EA así como para identificar los biomarcadores (proteínas o metabolitos secretados) que se pueden usar para diagnosticar y/o predecir si es probable que una persona desarrolle la EA. Debido a la EA, el SNC está relativamente aislado de los otros órganos y sistemas del organismo, la mayoría de la investigación (con respecto tanto a la etiología de la enfermedad como a los biomarcadores) se ha centrado en acontecimientos, expresión génica, biomarcadores, etc. dentro del sistema nervioso central. Con respecto a los biomarcadores, las proteínas beta-amiloide y tau son probablemente las mejor caracterizadas. La investigación ha demostrado que las muestras del líquido cefalorraquídeo ("LCR") de pacientes con EA contienen cantidades de tau más alas de lo normal, lo que se libera cuando se degeneran las neuronas, y cantidades de beta amiloide más bajas de lo normal, presuntamente porque queda atrapada en el cerebro en forma de placas amiloides. Debido a que estos biomarcadores se liberan en el LCR, se requiere una punción lumbar (o "punción espinal") para obtener una muestra para las pruebas.

Se han emitido varias patentes de los EE. UU. con relación a procedimientos para el diagnóstico de la EA, incluyendo las patentes de los EE. UU. N.º 4.728.605, 5.874.312, 6.027.896, 6.114.133, 6.130.048, 6.210.895, 6.358.681, 6.451.547, 6.461.831, 6.465.195, 6.475.161, 6.495.335, el documento US 2003/064416 y el documento US 2003/119074.

Adicionalmente, varios informes en la bibliografía científica hacen referencia a determinados marcadores bioquímicos y su correlación/asociación con la EA, incluyendo Fahnestock et al, 2002, J. Neural Transm. Supl. 2002 (62) :241-52; Masliah et al, 1195, Neurobiol. Aging 16 (4) :549-56; Power et al, 2001, Dement. Geriatr. Cogn. Disord. 12 (2) :167-70; y Burbach et al, 2004, J. Neurosci. 24 (10) :421-30. Adicionalmente, Li et al. (2002, Neuroscience 113 (3) :607-15) y Sanna et al. (2003, J. Clin. Invest. 111 (2) :241-50) han investigado la leptina con relación a la memoria y la esclerosis múltiple, respectivamente.

Los factores de crecimiento insulinoides y las proteínas de unión a factores de crecimiento insulinoides en el líquido cefalorraquídeo y el suero de pacientes con demencia de tipo Alzheimer se divulgan en Tham et al., Journal of neural transmission Parkinson's disease and dementia section 5 (1993) , 165-176. Los marcadores biológicos y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer se describen en Galasko, Journal of molecular neuroscience 17 (2001) , 119-125.

Breve sumario de la invención Los inventores han descubierto una colección de marcadores bioquímicos, presentes en el suero de los individuos, que están alterados en individuos con enfermedad de Alzheimer ("EA") . En consecuencia, estos biomarcadores ("biomarcadores de diagnóstico de EA") se pueden usar para evaluar la función cognitiva, para diagnosticar o ayudar en el diagnóstico de la EA y/o para medir la progresión de la EA en pacientes con EA. Los marcadores de 30 diagnóstico de EA se pueden usar individualmente o en combinación para el... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de ayuda en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer ("EA") , que comprende comparar un nivel medido de al menos un biomarcador de diagnóstico de la EA en una muestra de fluido biológico periférico de un individuo con un nivel de referencia para el biomarcador, en el que el biomarcador de diagnóstico de la EA es IGFBP-2 (proteína de unión al factor de crecimiento insulinoide 2) , en el que dicho nivel de referencia comprende:

(a) un nivel promedio obtenido de una población que no padece la EA; o

(b) un nivel medio o de la mediana de un grupo de individuos incluyendo pacientes con EA;

y en el que dicha muestra de fluido biológico periférico es una muestra de sangre u orina.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el al menos un biomarcador de diagnóstico de la EA es IGFBP-2 y uno o más de (a) IFN-y (interferón-gamma) ; IGFBP-1 (proteína de unión al factor de crecimiento insulinoide 1) ; BMP-6 (proteína morfogenética ósea 6) ; BMP-4 (proteína morfogenética ósea 4) ; Eotaxina-2; GCSF (factor estimulador de colonias de granulocitos) ; TARC (quimiocina regulada por activación y timo) ; RANTES; ANG (angiotensinógeno) ; PARC (quimiocina regulada por activación y pulmonar) ; Acrp30

(proteína relacionada con el complemento de adipocitos de 30 kDa) ; AgRP (ART) (proteína relacionada con agouti (transcritos relacionados con agouti) ) ; TIMP-1 (inhibidor tisular de metaloproteinasa 1) ; TIMP-2 (inhibidor tisular de metaloproteinasa 2) ; ICAM-1 (molécula de adhesión intercelular 1) ; TRAIL R3 (receptor 3 del ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral) ; uPAR (receptor activador de plasminógeno de tipo urocinasa) ; IGFBP-4 (proteína de unión al factor de crecimiento insulinoide 4) ;

leptina (OB) ; PDGF-BB (factor de crecimiento derivado de plaquetas BB) ; EGF (factor de crecimiento epidérmico) ; BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro) ; NT-3 (neurotrofina 3) ; NAP-2 (péptido de activación de neutrófilos 2) ; IL-1ra (antagonista del receptor de interleucina 1) ; MSP-α (proteína estimuladora de macrófagos alfa) ; SCF (factor de células madre) ; TGF-β3 (factor de crecimiento transformante, beta 3) ; TNFβ (factor de necrosis tumoral beta) ; MIP-1δ (proteína inflamatoria de macrófagos 1 delta) ; IL-3 (interleucina 3) ;

FGF-6 (factor de crecimiento fibroblástico 6) ; IL-6 R (interleucina-6 receptor) ; sTNF RII (receptor II del factor de necrosis tumoral soluble) ; AXL; bFGF (factor de crecimiento fibroblástico básico) ; FGF-4 (factor de crecimiento fibroblástico 4) ; CNTF (factor neurotrófico ciliar) ; MCP-1 (proteína quimioatractora de monocitos 1) ; MIP-1β (proteína inflamatoria de macrófagos 1 beta) ; TPO (trombopoyetina) ; VEGF-B (factor de crecimiento endotelial vascular B) ; IL-8 (interleucina 8) ; FAS; y EGF-R (receptor del factor de crecimiento epidérmico) , o (b) una cualquiera o más de las proteínas enumeradas en la tabla 7.

3. Un procedimiento para monitorizar la progresión de la enfermedad de Alzheimer (EA) en un paciente con EA, que comprende comparar un nivel medido de al menos un biomarcador de diagnóstico de la EA en una muestra de fluido biológico periférico de un individuo con EA con un nivel de referencia parar el biomarcador, en el que el biomarcador de diagnóstico de la EA es IGFBP-2, en el que dicho nivel de referencia:

(a) comprende además un valor obtenido de una muestra de fluido biológico periférico del mismo paciente con EA en un punto temporal temprano; o (b) se determina de forma contemporánea usando un conjunto de muestras de individuos con EA que incluye la muestra del individuo;

y en el que dicha muestra de fluido biológico periférico es una muestra de sangre u orina.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el al menos un biomarcador de diagnóstico de la EA es IGFBP-2 y una o más de IFN-y; IGFBP-1; BMP-6; BMP-4; Eotaxina-2; GCSF; TARC; RANTES; ANG; PARC; Acrp30; AgRP (ART) ; TIMP-1; TIMP-2; ICAM-1; TRAIL R3; uPAR; IGFBP-4; leptina (OB) ; PDGF-BB; EGF; BDNF; NT-3; NAP-2; IL-Ira; MSP-α; SCF; TGF-β3; TNF-β; MIP-1δ; IL-3; FGF-6; IL-6 R; sTNF RII; AXL; bFGF; FGF-4; CNTF; MCP-1; MIP-1Β; TPO; VEGF-B; IL-8; FAS; y EGF-R.

5. El procedimiento de la reivindicación 3 o 4, en el que el individuo con EA:

(i) es un individuo con EA cuestionable y puntuado con o que lograría una puntuación d.

2. 28 en la prueba MMSE;

(ii) es un individuo con EA leve y puntuado con o que lograría una puntuación d.

2. 27 en la prueba MMSE;

(iii) es un individuo con EA moderada y puntuado con o que lograría una puntuación de 16-21 en la prueba 50 MMSE;

(iv) es un individuo con EA grave y puntuado con o que lograría una puntuación de 12-15 en la prueba MMSE.

6. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, que comprende comparar los niveles medidos de al menos dos, tres, cuatro, cinco, diez, quince o veinte biomarcadores de diagnóstico de la EA con niveles de referencia para

los biomarcadores.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha muestra de sangre es una muestra de suero o plasma.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además obtener un

nivel medido de dicho al menos un biomarcador de diagnóstico de la EA en dicha muestra de fluido biológico periférico.

9. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, que comprende además la etapa de obtener un valor para la comparación del nivel medido con el nivel de referencia.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la diferencia en los valores

medidos del al menos un biomarcador de diagnóstico de la EA en muestras de individuos con EA en relación con muestras de individuos sin EA se determina por un procedimiento que comprende análisis de significación de micromatrices (SAM) , preferentemente en el que la diferencia en los niveles medidos del uno o más biomarcadores de diagnóstico de la EA determinada por SAM tiene un intervalo de valor q de desde 0, 0001 hasta 0, 05.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la diferencia en los valores medidos del al menos un biomarcador de diagnóstico de la EA en muestras de individuos con EA en relación con muestras de individuos sin EA se determina por un procedimiento que comprende una prueba t, preferentemente en el que la diferencia se mide en términos de un valor p.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la comparación de los valores medidos comprende un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en análisis de significación de micromatrices, recolección en árboles, CART, MARS, mapas de autoorganización, conjunto de elementos frecuentes, y redes bayesianas.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la determinación del nivel de referencia comprende:

determinar un valor medio de los valores medidos del al menos un biomarcador de diagnóstico de la EA en las muestras de fluido biológico periférico de un grupo de individuos con EA;

determinar un valor medio de los valores medidos del al menos un biomarcador de diagnóstico de la EA en las muestras de fluido biológico periférico de un grupo de individuos sin EA; y

encontrar una diferencia estadísticamente significativa entre los valores medios de los valores medidos del al 30 menos un biomarcador de diagnóstico de la EA en las muestras de fluido biológico periférico entre los dos grupos.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el grupo de individuos con EA y el grupo de individuos sin EA son poblaciones de edad coincidente.

Histograma celular Variable (s) de grupo: estadio Barras de error: ± 1 error (es) estándar Criterios de inclusión: Manchas de todos los centros Histograma celular Variable (s) de grupo: enfermedad Dividido por: sexo Barras de error: ± 1 error (es) estándar Exclusión de fila: todas las del centro Histograma celular Variable (s) de grupo: estadio Barras de error: ± 1 error (es) estándar Exclusión de fila: todas las del centro

Histograma celular Variable (s) de grupo: estadio Barras de error: ± 1 error (es) estándar Exclusión de fila: todas las del centro Histograma celular Variable (s) de grupo: estadio Barras de error: ± 1 error (es) estándar Exclusión de fila: todas las del centro

Histograma celular Variable (s) de grupo: estadio Barras de error: ± 1 error (es) estándar Exclusión de fila: todas las del centro