Procedimiento para el aislamiento de las proteínas unidas a cualquier tipo de secuencia de ácido nucleico de interés.

Procedimiento para el aislamiento de las proteínas unidas a cualquiera de los tipos de secuencia de ácidonucleico de interés (secuencia de interés:

SoI), en el que:

- en una primera etapa, una secuencia etiqueta formadora de tríplex (secuencia TFT) se introduce en dichasecuencia de ácido nucleico de una célula viva y dichas células vivas se hacen crecer;

- en una segunda etapa, las células obtenidas en la etapa 1 se entrecruzan;

- en una tercera etapa dichas células vivas entrecruzadas obtenidas en la etapa 2 se recogen y se mezclancon una sonda molecular específica de la secuencia TFT introducida (la sonda TFO) bajo unas condicionesque permiten la formación de tríplex de ácido nucleico;

- en una cuarta etapa, el tríplex de ácido nucleico formado en la tercera etapa se aísla y se analizan lasproteínas unidas.

Procedimiento para el aislamiento de las proteínas unidas a cualquier tipo de secuencia de ácido nucleico de interés.

El ADN eucariota está unido y es interpretado por muchos complejos de proteínas en el contexto de la cromatina.

La descripción del grupo completo de proteínas que regulan el locus específico es fundamental para entender la expresión y la regulación de los genes.

Los metabolismos celulares, como el mantenimiento del genoma, la expresión del gen, la proliferación celular programada, y otros, se archivan (indexan) en la cromatina mediante mecanismos de combinaciones específicas de proteínas altamente reguladas que transportan modificaciones traslacionales y que forman parte de las redes de proteínas.

A pesar de los diversos intentos de caracterización, los cromosomas siguen siendo unos orgánulos celulares poco caracterizados (Komberg and Lorch, 2007) .

Entender la forma en la que se codifica y se almacena la historia transcripcional en la cromatina es un gran reto que actualmente resulta limitado por la falta de procedimientos adecuados para aislar fragmentos específicos de cromatina, en adelante denominado cromatina de Interés (CoI) , y para analizar su contenido proteico en función de las condiciones de crecimiento, el ciclo celular, el tipo celular…

El término fragmento de “cromatina de Interés” se refiere al complejo entre una secuencia específica de ácidos nucleicos (es decir, un gen determinado) y todas las proteínas asociadas.

El aislamiento de estos fragmentos de nucleoproteínas específicos es una tarea especialmente difícil debido al gran tamaño de los genomas como el caso del genoma humano (3 x 109 bp) .

Para aislar el fragmento de cromatina asociado a un único gen humano (tamaño medio hipotético de 3 kb) , sería necesario aislar 1 fragmento de entre 106 fragmentos.

Existe la necesidad de procedimientos que simplifiquen el aislamiento de fragmentos CoI.

En los últimos 25 años, se han seguido diferentes estrategias para aislar la cromatina para establecer el locus específico de la composición de la proteína.

Zahedi et al., en Inflammation 26, 183-191 (2002) dan a conocer el aislamiento de proteínas que se unen a la región del promotor C1INH formadora de tríplex.

Déjardin and Kingston (Cell 136, 175-186, Januar y 9, 2009) describen un procedimiento basado en la hibridación de Watson-Crick para aislar telómeros que contienen los fragmentos de cromatina.

Pero esta técnica sólo se puede utilizar en fragmentos de telómeros que contienen regiones que presentan una sola hebra (extremo saliente 3’) que son capaces de hibridar con una sonda de oligonucleótidos complementaria mediante el emparejamiento de las bases de Watson-Crick.

Los telómeros son un excepción porque (1) originalmente contienen ADN de cadena sencilla de secuencias conocidas que por consiguiente pueden formar los pares de bases de Watson-Crick con una sonda complementaria,

(2) están sobrerepresentados porque que existen 92 telómeros/célula.

Por consiguiente, la técnica descrita no es universal y no permite el aislamiento del fragmento de nucleoproteína fuera del extremo de los cromosomas, es decir, en una de las partes del cromosoma, más ventajosamente independientemente de la secuencia de ácido nucleico de los fragmentos de interés.

Existe la necesidad de un procedimiento que permita el aislamiento de fragmentos de nucleoproteínas de interés, localizados en una parte del cromosoma, ventajosamente los fragmentos de cromatina, más ventajosamente independientemente de la secuencia de ácido nucleico de los fragmentos de interés.

Uno de los objetivos de la presente invención es proponer este procedimiento.

La invención sirve para proporcionar una forma novedosa para el aislamiento y la identificación de proteínas unidas a un tipo de secuencia de ADN de interés, (secuencia de Interés: SoI) , ventajosamente un tipo de secuencia de ADN de interés, especialmente en el contexto de un ADN o ARN cromosómico o un ADN episomal en células vivas o en tubos de ensayo.

En el contexto de la presente invención, las células vivas incluyen todos los organismos que contienen material de ácido nucleico como por ejemplo, virus, bacterias, células, cuyas proteínas unidas deben analizarse.

La invención se basa en la utilización de una secuencia marcada de ácido nucleico específica, ventajosamente un ADN de doble cadena específico capaz de formar una triple hélice, denominada secuencia formadora de tríplex, (secuencia TFT) , que se encuentra localizada próxima a la secuencia SoI.

La invención se ha adaptado para todas las fuentes de ácido nucleico (Sol) en uno de los tipos de células vivas como las definidas anteriormente, ya que unas etiquetas formadoras tríplex cortos (TFT) de una longitud predeterminada, se pueden introducir cerca de dicha secuencia de interés (Sol) y de las proteínas a las que están unidas.

Ventajosamente, la invención se ha adaptado para una de las fuentes de ADN (cromosómico, episomal, vírico…) .

Según la invención, la secuencia TFT puede encontrase en las células como parte de un ADN episomal o integrada próxima a la secuencia estudiada de ácido nucleico de interés.

Según la invención, la secuencia TFT puede formar un complejo estable en forma de una triple hélice con una sonda específica de oligonucleótidos que se denomina Oligonucleótido formador de tríplex (TFO) .

Sea cual sea la forma final de la secuencia TFT (episomal o integrada) , puede presentarse en forma de una sola secuencia o de secuencias repetidas. Cuando se presenta en forma de secuencias repetidas, las secuencias repetidas se pueden organizar extremo a extremo o extremo a final, contiguas o espaciadas.

Por consiguiente, según la invención, la primera etapa del procedimiento consiste en introducir una secuencia TFT próxima al complejo de proteínas Sol del cual se analizará.

Cuando la TFT se introduce próxima a la Sol, la Sol y sus proteínas asociadas se pueden purificar a partir de una mezcla de complejos de fragmentos de ácido nucleico no relacionados mediante la utilización de la sonda TFO.

Por consiguiente, un primer objeto de la invención se refiere a un nuevo procedimiento para el aislamiento de la unión de proteínas a cualquier secuencia de ácido nucleico de interés (Secuencia de interés: Sol) , en el que:

-en una primera etapa, una etiqueta formadora de tríplex (TFT) se introduce en dicha secuencia de ácido nucleico de una célula viva y estas células vivas se dejan crecer;

-en una segunda etapa, las células obtenidas en la etapa 1 se entrecruzan;

-en una tercera etapa, estas células vivas entrecruzadas obtenidas en la etapa 2, se recogen y se mezclan con una sonda molecular específica de la TFT introducida (la sonda TFO) bajo unas condiciones que permitan la formación de tríplex de ácido nucleico;

-en una cuarta etapa, el tríplex de ácido nucleico formado en la tercera etapa se aísla y se analizan las proteínas unidas.

Según la invención, una secuencia de ácido nucleico de interés (Sol) puede ser ADN (ácido desoxirribonucleico) o ARN (ácido ribonucleico) , ventajosamente ADN, más ventajosamente ácido nucleico genómico (ADN o ARN) , preferentemente ADN genómico o ADN episomal.

Según la primera etapa de la invención, la TFT puede formar parte de un ácido nucleico de doble cadena lineal o circular (la TFT que contiene el ácido nucleico) , preferentemente ADN de doble cadena lineal o circular.

En una primera forma de realización de la invención, la TFT que contiene el ácido nucleico se puede mantener en la célula como un episoma. Según esta forma de realización, la TFT que contiene el ácido nucleico será un ácido nucleico circular, preferentemente un plásmido que incluye además la secuencia TFT de origen viral.

En una segunda forma de realización de la invención, la TFT que contiene el ácido nucleico se puede introducir en dicha secuencia de ácido nucleico aleatoriamente o de forma directa, es decir, introduciéndola próxima a una Sol predeterminada. Cuando la TFT que contiene la inserción del ácido nucleico se realiza aleatoriamente será posible analizar las SoI desconocidas. Para esto, la TFT que contiene el ácido nucleico puede ser un tipo de ADN, ventajosamente comprende además una secuencia indicadora utilizada como un marcador para detectar las células que presentan dicho ADN integrado.

Cuando la TFT que contiene la inserción el ácido nucleico se realiza de una forma directa a través de una recombinación homóloga o específica del... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el aislamiento de las proteínas unidas a cualquiera de los tipos de secuencia de ácido nucleico de interés (secuencia de interés: SoI) , en el que:

- en una primera etapa, una secuencia etiqueta formadora de tríplex (secuencia TFT) se introduce en dicha secuencia de ácido nucleico de una célula viva y dichas células vivas se hacen crecer;

- en una segunda etapa, las células obtenidas en la etapa 1 se entrecruzan;

- en una tercera etapa dichas células vivas entrecruzadas obtenidas en la etapa 2 se recogen y se mezclan con una sonda molecular específica de la secuencia TFT introducida (la sonda TFO) bajo unas condiciones que permiten la formación de tríplex de ácido nucleico;

- en una cuarta etapa, el tríplex de ácido nucleico formado en la tercera etapa se aísla y se analizan las proteínas unidas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ácido nucleico de interés es ácido nucleico genómico, preferentemente ADN genómico o ADN episomal.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en la que dicha secuencia TFT es una secuencia que normalmente no está presente en la secuencia de ácido nucleico en la que la SoI está presente.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha secuencia TFT es una secuencia polipirimidina-polipurina.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha secuencia TFT es una secuencia etiqueta corta formadora de tríplex (secuencia TFT) que presenta una longitud comprendida entre 10 y 50 pares de bases, preferentemente entre 15 y 35 pares de bases, y más preferentemente de aproximadamente 20 pares de bases de longitud.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células se entrecruzan utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica que permite el entrecruzamiento proteína-proteína y/o proteína/ácido nucleico, seleccionado de entre entrecruzamiento con luz UV, procedimiento de entrecruzamiento con formaldehído, cromo hexavalente, adipimidato de dimetilo (DMA) ; suberato de disuccinimidilo (D88) ; ditiobis[propionato de succinimidilo] (D8P) ; etilenglicolbis[succinato de succinimidilo] (EG8) , utilizando preferentemente el procedimiento de entrecruzamiento in vivo con formaldehído.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se realiza una etapa adicional de purificación o aislamiento de los núcleos celulares antes de la adición de TFO.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se realiza una etapa adicional de fragmentación celular antes de la etapa de purificación o aislamiento de los núcleos celulares.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la etapa de fragmentación es mecánica, enzimática o a través de sonicación.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha sonda TFO es una secuencia de ácido nucleico, complementaria a la TFT insertada, sola o combinada con otros elementos que aumentan su eficacia.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha TFO es una secuencia de ácidos nucleicos que comprende nucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) mezclados con nucleótidos de ADN normal.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dichas citosinas de TFO se reemplazan con 5-metil citosina.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha TFO comprende en su extremo 5’ un compuesto químico compuesto por cualquier estructura aromática en anillo que funciona como un intercalador, preferentemente un agente de intercalación foto activable como psolareno, acridina, bromuro de etidio, berberina, proflavina, daunomicina, doxorrubicina, talidomida, quinacrina u ortofenantrolina.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicha TFO es una secuencia de ácido nucleico que comprende nucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) mezclados con nucleótidos normales,

que comprende en su extremo 5’ un compuesto químico compuesto por una estructura aromática en anillo, preferentemente un agente de intercalado, y en el que las citosinas se reemplazan por 5-metil citosina.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que en dicha sonda TFO, la sonda con una estructura aromática en anillo en su extremo 5’ es seguida en su extremo 3’ por un agente de unión conectado a un asa de captura que se puede capturar específicamente por un gancho de captura correspondiente.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho agente de unión es un espaciador de carbono que puede presentar una longitud comprendida entre 1 y 300 átomos de carbono, preferentemente entre 100 y 200, más preferentemente entre 110 y 130 átomos de carbono.

17. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el asa de captura y el gancho de captura correspondiente es cualquier par de moléculas que interactúan fuertemente, como cualquier tipo de materiales que presentan una interacción de afinidad como, la combinación histidina-metal, antígeno-anticuerpo (por ejemplo, FLAG-anti FLAG) , oligonucleótido específico-proteína de unión de oligonucleótido específico (por ejemplo, IacO-LacI) .

18. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho gancho de captura correspondiente es estreptavidina o avidina o neutravidina y el asa de captura preferida es la biotina o un equivalente, tal como destiobiotina.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que dicho gancho se fija sobre una columna o sobre unas microesferas, preferentemente microesferas magnéticas.

20. Utilización del procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para la preparación de un complejo nucleótido-proteína.

21. Kit para la implementación del procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, comprendiendo dicho kit (1) por lo menos una secuencia TFT que se debe introducir próxima a la SoI en la secuencia del ácido nucleico de una célula viva, (2) por lo menos un compuesto entrecruzado, (3) por lo menos una sonda molecular (sonda TFO) específica de la secuencia TFT y que puede formar un tríplex de ácido nucleico con la secuencia TFT y que contiene un asa de captura, y (4) un gancho constituido por un compuesto que se puede unir al asa de captura de la TFO, siendo dicha TFT, dicho compuesto de entrecruzamiento, dicha sonda molecular específica de la secuencia TFT y dicho gancho como se describen en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.