Procedimiento de diagnóstico in vitro de cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL.

Procedimiento de diagnóstico in vitro de cepas de Staphylococcus aureus productoras de la leucocidina dePanton-Valentine (PVL) a partir de una muestra biológica obtenida de un individuo propenso a ser colonizado oinfectado por Staphylococcus aureus,

realizándose el diagnóstico por detección de la PVL por un inmunoensayode rutina, caracterizado porque dicha muestra biológica se trata previamente para desnaturalizar la PVL.

Procedimiento de diagnóstico in vitro de cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL.

La presente invención se refiere a las infecciones asociadas con la presencia de bacterias que pertenecen al género Staphylococcus y a la especie Staphylococcus aureus productora de leucocidina de Panton-Valentine (conocida por su abreviatura en inglés PVL, por la expresión Panton Valentine Leukocidin) . Más particularmente, la presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación de cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL por un inmunoensayo de rutina en una muestra biológica que pueda contener cepas de Staphylococcus aureus.

Las infecciones por cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL son las principales responsables de infecciones extrahospitalarias. La bacteria Staphylococcus aureus expresa una gran variedad de factores de virulencia, entre los cuales se encuentra la leucocidina de Panton-Valentine (PVL) , que es una citotoxina que favorece las lesiones tisulares1. La PVL es una toxina presente frecuentemente en cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina y transmisibles extrahospitalariamente (abreviadamente CA-MRSA por la expresión inglesa «Community acquired methicillin-resistant S. aureus») propagándose en el mundo entero2 .

La PVL, así como otras leucocidinas es una proteína perteneciente a la familia de las toxinas sinergohimenotrópicas. Todas las toxinas de esta familia están constituidas por dos componentes polipeptídicos, de acción sinérgica, denominados S y F. La PVL es codificada por dos genes contiguos cotranscritos, lukF-PV y lukS-PV. La PVL es una exotoxina porque es excretada en el medio extracelular después de la lisis o no de la bacteria, a diferencia de las endotoxinas o lipopolisacáridos, que no son liberadas más durante la destrucción de la bacteria Gram-negativa que las secreta.

Las cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL, son bacterias Gram-positivas, asociadas a determinadas infecciones humanas, tales como infecciones cutáneas, subcutáneas de tipo forúnculos, abscesos, celulitis y miositis, infecciones osteoarticulares, así como neumonías necrosantes graves que afectan principalmente a niños y adultos jóvenes con una tasa de mortalidad de aproximadamente el 70%.

La patogénesis no se conoce completamente, pero varias líneas de evidencia sugieren que la PVL desempeña una función importante en la fisiopatología de las infecciones por cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL:

i) la fuerte relación epidemiológica con los aislados de S. aureus que sintetizan la PVL y la presentación clínica de la infección,

ii) la elevada frecuencia de leucopenia, un efecto conocido de la PVL,

iii) las lesiones necróticas del tracto respiratorio, que se asemejan a la necrosis inducida por inyección intradérmica de la PVL en conejos,

iv) la presencia de PVL en el pulmón al que se dirigen las células polimorfonucleares,

v) solo las cepas productoras de PVL o la PVL purificadas inducen una neumonía necrosante en los modelos experimentales7 .

La detección de cepas de S. aureus productoras de PVL se realiza actualmente por ensayos de detección de ácidos nucleicos, y principalmente por detección de los genes lukF-PV y lukS-PV, por PCR3.

Dichos ensayos tienen como inconvenientes ser indirectos porque no permiten afirmar que el gen sea funcional y/o expresado, son caros debido a la necesidad de equipo específico, poco rápidos y difíciles de realizar. Además, en el contexto de la utilización de una PCR, pueden ocurrir problemas de contaminación.

La detección de la PVL ha sido igualmente realizada siempre por inmunodifusión con ayuda de anticuerpos policlonales4, pero esta técnica se abandonó rápidamente en favor de la detección de genes, porque no es fácil y difícilmente estandarizable, de modo que no es una buena herramienta para ser utilizada rutinariamente.

Debido a la gravedad de ciertas infecciones por cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL, es urgente disponer de un ensayo rápido y sencillo de realizar, que supere las desventajas de los ensayos actualmente utilizados para la detección de cepas de S. aureus productoras de PVL.

La solicitud de patente europea EP 597110 A describe que la detección de MRSA puede ser realizada por inmunoensayos de rutina usando anticuerpos monoclonales anti-PVL. Sin embargo, aunque estos ensayos permiten superar los inconvenientes anteriores, la especificidad de la detección no es suficiente.

La publicación científica de Kasai et al., (Kasai S. et al., 2000, Analytical Chemistr y , 72 (23) :5761-5765) se refiere al diagnóstico in vitro de cepas de Staphylococcus aureus productoras de leucocidina de Panton-Valentine (PVL) y describe un procedimiento para detectar la PVL por un inmunoensayo de rutina sin la etapa preliminar de desnaturalización de la muestra.

Contra toda expectativa, los inventores han demostrado ahora que la especificidad de la detección de las cepas de S. aureus productoras de PVL por un inmunoensayo de rutina podría mejorarse mediante un tratamiento previo de la muestra biológica para desnaturalizar la PVL, puesto que los expertos en la técnica saben que, como cualquier exotoxina, la PVL es sensible a los agentes físico-químicos, como la temperatura5.

Por lo tanto, la presente invención tiene por objeto un procedimiento para el diagnóstico in vitro de cepas de Staphylococcus aureus productoras de leucocidina de Panton-Valentine (PVL) a partir de una muestra biológica obtenida de un individuo propenso a ser colonizado o infectado por Staphylococcus aureus, realizándose el diagnóstico mediante la detección de la PVL por un inmunoensayo de rutina, caracterizado porque dicha muestra biológica se trata previamente con el fin de desnaturalizar la PVL.

Por la expresión cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL, se entiende todas las cepas de Staphylococcus aureus capaces de producir la PVL, a saber, tanto las cepas sensibles a la meticilina (abreviadamente MSSA por la expresión inglesa methicillin sensible-Staphylococcus aureus) como las resistentes a la meticilina (MRSA por la expresión inglesa methicillin resistant-Staphylococcus aureus) .

Por individuos propensos a ser colonizados por Staphylococcus aureus, se entiende los individuos con riesgo de poder ser portadores sanos de esta bacteria, tales como el personal de hospitales. Por individuo propenso a ser infectado por Staphylococcus aureus, se entiende los pacientes que muestran síntomas de infección por Staphylococcus aureus.

Por infección por Staphylococcus aureus, se entiende cualquier infección provocada por la presencia de esta bacteria en un organismo, aunque estas infecciones sean por las cepas de Staphylococcus aureus productoras de PVL o por cepas de Staphylococcus aureus que no tengan dicha capacidad. Como ejemplo de tales infecciones, se pueden citar infecciones supurativas de la piel y de los tejidos blandos, infecciones de las vías respiratorias, infecciones del sistema nervioso central, infecciones de las vías urinarias, infecciones endovasculares y de las válvulas del corazón e infecciones musculares y óseas. Tales infecciones y sus síntomas asociados son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica y se describen por ejemplo en el texto Précis de Bacteriologie Clinique5.

Por muestra biológica obtenida de un individuo propenso a ser colonizado o infectado por Staphylococcus aureus, se entiende cualquier muestra susceptible de contener estas bacterias o bien la PVL excretada, tal como pus, exudado respiratorio, exudado nasal, orina o hemocultivo.

La muestra biológica utilizada en el procedimiento de la invención puede ser la muestra sin modificar o puede ser un cultivo bacteriano procedente de esta muestra. El cultivo puede ser realizado en un medio sólido, tal como una placa de Petri o en un caldo, entendiéndose que el caldo de cultivo puede ser inoculado por dicha muestra o por colonias de Staphylococcus aureus aisladas previamente de dicha muestra biológica mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como por siembra en placas de Petri. El inmunoensayo se utilizará entonces o bien directamente sobre el medio sólido o bien en el caldo de cultivo. En general, el cultivo de las bacterias de interés o de dicha muestra dura alrededor de 24 horas. Cabe señalar que, cualquiera que sea el cultivo, el medio de cultivo comprende un agente que favorezca la producción de PVL, como el medio CCY (medio de hidrolizado de caseína y extracto de levadura) , con o sin el uso de moléculas que permitan una mayor producción de PVL, tales como oxacilina y bacitracina en dosis sub-inhibidoras.

1. Procedimiento de diagnóstico in vitro de cepas de Staphylococcus aureus productoras de la leucocidina de Panton-Valentine (PVL) a partir de una muestra biológica obtenida de un individuo propenso a ser colonizado o infectado por Staphylococcus aureus, realizándose el diagnóstico por detección de la PVL por un inmunoensayo de rutina, caracterizado porque dicha muestra biológica se trata previamente para desnaturalizar la PVL.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el inmunoensayo de rutina es un método de tipo sándwich.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inmunoensayo utiliza al menos un anticuerpo monoclonal anti-PVL.

4. Procedimiento según la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque el método de tipo sándwich es un ensayo ELISA.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el tratamiento previo consiste en un calentamiento a una temperatura comprendida entre 60 y 100ºC, durante un período de al menos 10 minutos.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el tratamiento previo consiste en un calentamiento a una temperatura comprendida entre 60 y 100ºC y una duración comprendida entre 10 y 30 minutos.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el tratamiento previo consiste en la desnaturalización de la PVL por un ácido.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el ácido es KH2PO4.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende una etapa adicional que consiste en determinar si las Staphylococcus aureus presentes en dicha muestra biológica son bacterias resistentes a la meticilina (MRSA) o sensibles a meticilina (MSSA) .