Un procedimiento para diagnosticar placas ateroescleróticas midiendo CD36.

Un procedimiento para diagnosticar placas ateroescleróticas como inestables y/o diagnosticar estenosisprovocada por placas ateroescleróticas inestables en un individuo,

comprendiendo dicho procedimiento, en unamuestra de sangre de dicho individuo,

(i) determinar la concentración de un polipéptido de CD36 soluble,

(ii) correlacionar dicha concentración determinada en i) con un nivel de referencia y

(iii) basándose en dicha correlación de acuerdo con ii), diagnosticar dichas placas ateroescleróticas comoinestables y/o diagnosticar estenosis provocada por placas ateroescleróticas inestables

Un procedimiento para diagnosticar placas ateroescleróticas midiendo CD36

Campo técnico de la invención La presente invención se refiere al diagnóstico, clasificación y seguimiento de placas ateroescleróticas usando la medida de la concentración de CD36 en un fluido corporal y/o la propia placa.

Antecedentes de la invención La ateroesclerosis es una enfermedad inflamatoria progresiva en la que se acumulan en la pared arterial lípidos, matriz extracelular, macrófagos y células de la musculatura lisa vascular activadas, dando lugar a la aparición de una placa ateroesclerótica. La progresión de las lesiones ateroescleróticas puede desencadenar episodios isquémicos diversos, tales como síndromes coronarios agudos, accidentes isquémicos transitorios (AIT) y apoplejía, debidos a que partes de la placa se sueltan y se transportan por el torrente circulatorio hasta que la placa se detiene porque el tamaño de la placa supera el tamaño de la arteria. Sin embargo, aunque se ha extendido el conocimiento de la participación de mediadores inflamatorios en el proceso ateroesclerótico, no está clara la identificación de los diferentes componentes, ni su importancia relativa. En particular, no se comprende totalmente la manera en que la inflamación puede promover la transición desde una placa fibroateromatosa asintomática hasta una lesión vulnerable y sintomática.

La CD36 tiene numerosas funciones celulares. Es una translocasa de ácidos grasos (FAT) y pertenece a la familia de receptores secuestrantes de clase B, desempeñando un papel importante en la incorporación de ácidos grasos de cadena larga (AGCL) sobre la membrana celular en tejido metabólicamente activo, en la formación de células espumosas y en la incorporación de OxLDL por macrófagos. Después, los macrófagos ricos en lípidos se diferencian a o adquieren las características de células espumosas y contribuyen a la formación de lesiones ateroescleróticas. Además, la CD36 de los macrófagos, junto con la TSP y la integrina alphavbeta3, puede fagocitar neutrófilos apoptósicos. Por otro lado, la proteína es uno de los receptores de colágeno en la adhesión y agregación de plaquetas. Además, la CD36 citoplásmica desempeña un papel importante en la transducción de señales al interaccionar con tirosina cinasas de la familia Src. La deficiencia en CD36 en poblaciones asiáticas y africanas se ha asociado con la resistencia a la insulina. Los nombres alternativos para la CD36 (determinante agrupado 36) incluyen CD36 [nomenclatura de genes HUGO], GPIIIb, GPIV, antígeno OKM5 y PASIV.

El documento EP1431399 se refiere a un procedimiento para identificar agentes terapéuticos para reducir y realizar un seguimiento del crecimiento, la erosión, la ruptura o la estabilidad de una placa ateroesclerótica que comprende el análisis de la expresión diferencial de al menos dos genes que codifican proteínas escogidas de entre estearoil CoA desaturasa, ácido fosfatídico fosfatasa y fosfolipasa específica de fosfoinosítido B1.

El documento JP 2000 180447 describe la determinación de infarto de miocardio agudo detectando un antígeno CD36 en una muestra de un organismo tomada de un ser humano y comparando la cantidad de antígeno CD36 detectada con la de una persona con un organismo sano normal. Nakagawa-Toyama et al. (Atherosclerosis. jun. de 2001;156 (2) :297-305) estudiaron la localización de CD36 en lesiones coronarias ateroescleróticas humanas y descubrieron que la expresión de CD36 en estas lesiones se aceleraba en paralelo con la progresión de la ateroesclerosis.

Nakata et al. (Arterioscler Thromb Vase Biol. mayo de 1999; 19 (5) : 1333-9) estudiaron la localización inmunohistoquímica de CD36 en aorta humana y descubrieron que la CD36 se expresa altamente sobre macrófagos cargados de lípidos en aorta humana ateroesclerótica.

Sumario de la invención Los presentes inventores han descubierto que la concentración aumentada de CD36 en una muestra de fluido corporal de un individuo que tiene una placa ateroesclerótica o en una placa ateroesclerótica como tal se correlaciona con un aumento del riesgo de que dicha placa ateroesclerótica se convierta en una placa ateroesclerótica sintomática.

Por tanto, la presente invención se refiere a procedimientos para diagnosticar, clasificar y realizar un seguimiento de placas ateroescleróticas, por ejemplo, con el fin de distinguir placas ateroescleróticas estables de placas ateroescleróticas inestables. Además, en el presente documento se sugiere que la proteína CD36 circulante, que no está unida a células (CD36 soluble, (sCD36) ) o una fracción o fragmento de la misma, opcionalmente como parte de un complejo lipoproteico, puede ser un marcador diagnóstico o predictivo útil para placas ateroescleróticas en vasos sanguíneos, en particular en arterias carótidas y arterias coronarias.

Se ha descubierto que la concentración de CD36 tanto en plasma como en las placas ateroescleróticas aumenta con la progresión de las placas ateroescleróticas hacia placas ateroescleróticas sintomáticas. En consecuencia, se puede usar el aumento de la concentración de CD36 como indicación de la progresión de las placas ateroescleróticas. Se puede usar el procedimiento para diagnosticar el riesgo de un individuo de desarrollar un episodio isquémico como se describe en el presente documento y, además, se puede usar el procedimiento para realizar un seguimiento de un individuo durante un periodo en el que se observa si una placa ateroesclerótica progresa o no.

Así, un aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar una (s) placa (s) ateroesclerótica (s) en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento, en una muestra de dicho individuo, i) determinar la concentración de un polipéptido de CD36, ii) correlacionar dicha concentración determinada en i) con un nivel de referencia y iii) basándose en dicha correlación de acuerdo con ii) , diagnosticar dicha (s) placa (s) ateroesclerótica (s) .

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar la estenosis provocada por placas ateroescleróticas en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento, en una muestra de dicho individuo, i) determinar la concentración de un polipéptido de CD36, ii) correlacionar dicha concentración determinada en i) con un nivel de referencia y iii) basándose en dicha correlación de acuerdo con ii) , diagnosticar el grado de estenosis provocado por placas ateroescleróticas en un individuo.

En un último aspecto, la presente invención se refiere a un kit para su uso en los procedimientos divulgados en el presente documento, en el que el kit comprende al menos un elemento de detección. Se aprecia que el elemento de detección es al menos un anticuerpo, en el que dicho anticuerpo se dirige contra el polipéptido de CD36 o parte del mismo. Además, se debe entender que el elemento de detección se selecciona del grupo que consiste en al menos un cebador, al menos una sonda y al menos un par de cebadores que puede detectar una molécula de ácido nucleico que codifica CD36.

Dibujos Figura 1:

CD36 soluble (sCD36) en plasma de pacientes con ateroesclerosis carotídea de acuerdo con la estabilidad de la placa. Los datos se dan como función del periodo de tiempo desde los últimos síntomas clínicos. La estenosis carotídea se diagnosticó y clasificó por ecografía dúplex a color precerebral (1) y angiotomografía (2) de acuerdo con criterios de consenso. La sCD36 es más alta en pacientes que habían experimentado síntomas clínicos en los últimos 2 meses (< 2 meses) , en comparación con pacientes que habían experimentado síntomas 3-6 meses (3-6 meses) o más de 6 meses (> 6 meses) , desde los últimos síntomas antes de la exploración y la toma de muestras de sangre. N = número de pacientes, p = nivel de significación (prueba de la U de Mann-Whitney) . La sCD36 en plasma se mide como unidades relativas, es decir, con respecto a una reserva de plasma con EDTA de la toma de muestras de sangre hospitalaria rutinaria. Los síntomas clínicos de placas indican la presencia de síntomas cerebrovasculares. Las placas ateroescleróticas sintomáticas son placas en pacientes con apoplejía, AIT (accidente isquémico transitorio) o amaurosis fugaz homolateral por arteria carótida interna estenósica. Las barras de error representan el EEM.

(1) Grant EG, Benson CB, Moneta GL et al. Carotid arter y stenosis: gray-scale and Doppler US diagnosis - Society of Radiologists in Ultrasound Consensus Conference, Radiology. 2003; 229:340-346

(2) Anderson GB, Asforth R, Steinke DE et al. CT angiography for the detection and characterization of carotid arter y bifurcation disease. Stroke.... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para diagnosticar placas ateroescleróticas como inestables y/o diagnosticar estenosis provocada por placas ateroescleróticas inestables en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento, en una muestra de sangre de dicho individuo,

(i) determinar la concentración de un polipéptido de CD36 soluble,

(ii) correlacionar dicha concentración determinada en i) con un nivel de referencia y

(iii) basándose en dicha correlación de acuerdo con ii) , diagnosticar dichas placas ateroescleróticas como inestables y/o diagnosticar estenosis provocada por placas ateroescleróticas inestables.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha muestra es una muestra sin células.

3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra es una muestra de plasma.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que un aumento de la concentración de CD36 de al menos 1, 15 del nivel de referencia es una indicación de una placa ateroesclerótica en progresión.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha concentración de dicho polipéptido de CD36 o parte del mismo se determina en

(i) una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 4,

(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de (i) .

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de polipéptido de CD36 se determina

(i) proporcionando un anticuerpo anti-CD36,

(ii) exponiendo la muestra al anticuerpo anti-CD36

(iii) opcionalmente, exponiendo dicho complejo CD36-anticuerpo a al menos un anticuerpo adicional dirigido contra dicho complejo CD36-anticuerpo y

(iv) detectando y cuantificando la cantidad de dicho anticuerpo.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido de CD36 se determina

(i) proporcionando un anticuerpo anti-CD36,

(ii) exponiendo la muestra que se va a estudiar al anticuerpo anti-CD36 unido a una fase sólida,

(iii) opcionalmente, exponiendo el complejo CD36-anticuerpo a un segundo anticuerpo anti-CD36 y

(iv) detectando y cuantificando la cantidad del anticuerpo que se une a CD36.

8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, en el que dicho procedimiento inmunológico es un inmunoensayo enzimático ELISA en fase sólida en el que en la etapa (iii) se pone en contacto la muestra con dicho anticuerpo unido a una fase sólida.

9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la fase sólida es una placa de microvaloración.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que dicho anticuerpo anti-CD36 se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos monoclonales y policlonales específicos frente a CD36.

11. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho anticuerpo anti-CD36 se selecciona del grupo de anticuerpos que consiste en sc5522 (CD36 (N-15) , IgG de cabra (epítopo N-terminal (h) ) , sc9154 (CD36 (H-300) , IgG de conejo (epítopo 1-300 (h) ) y sc7309 (CD36 (SMf) , IgM de ratón) .

12. Uso de un kit para el procedimiento como se define en la reivindicación 1, que comprende al menos un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de CD36 o parte del mismo.