Determinación del estado de gestación.

Un método para determinar el estado de gestación en un animal ungulado rumiante o no rumiante,

así como enun animal rumiante sin pezuña, que comprende, por una parte, la determinación del nivel de expresión extrauterinade una proteína inducida por la gestación seleccionada del grupo compuesto por 2'-5' oligoadenilato sintetasa,proteína ubiquitina de reacción cruzada y proteína Mx en un fluido corporal recogido del animal durante los 12-30días siguientes a la fecundación y, por otra, la comparación del nivel de expresión de la mencionada proteína en elanimal con el de un animal no preñado de la misma especie.

Determinación del estado de gestación Campo de la invención La invención se refiere a los métodos para determinar el estado de gestación de ungulados rumiantes y no rumiantes, así como de animales rumiantes sin pezuña.

Antecedentes de la invención En la cría de ganado, es muy importante determinar de forma precisa el estado de gestación de los animales. En particular, la identificación precisa y temprana de la concepción fallida de un animal que ha sido fecundado resulta importante desde un punto de vista económico. En la actualidad, una vez que un animal es fecundado, por ejemplo una vaca, el estado de gestación se determina mediante métodos como la palpación, que no permite una determinación precisa del estado de gestación hasta 30 días después de la fecundación. Dado que el ganado tiene un ciclo estral de unos 21 días, esto significa que con los métodos disponibles en la actualidad se pierde al menos una oportunidad de fecundar a un animal que no ha conseguido concebir, es decir el ciclo estral inmediatamente posterior a la fecundación fallida.

Esto tiene importantes consecuencias económicas para el sector ganadero y especialmente para el sector lechero. Una explotación lechera eficiente exige que las vacas sean fecundadas con éxito para que comiencen un nuevo estado de gestación entre 80 y 100 días después de parir. No obstante, las vacas lecheras tienen una tasa de fertilidad baja con la inseminación artificial y precisan una media de 2, 5 a 3 inseminaciones por concepción. Por tanto, existe una necesidad significativa de un método por el que el explotador de una explotación lechera pueda determinar de forma precisa si un animal no está preñado, sin perder la oportunidad de volver a fecundar al animal en el siguiente ciclo estral tras una concepción fallida.

Sasser, Patente estadounidense nº 4.705.748, divulga un método para determinar la gestación mediante la detección de una proteína que produce un embrión. A través de este método se determinó el estado de gestación tan solo 27 días después de la fecundación. Sasser no divulga el diagnóstico de la gestación antes de ese momento, por lo que ya habrá comenzado el siguiente ciclo estral del ganado no gestante y no divulga ningún método para la determinación temprana de la fecundación fallida.

El reconocimiento maternal de la gestación en ungulados implica la regulación genética local y sistémica por parte del embrión que resulta en una producción reducida o alterada de la señal luteolítica, la prostaglandina F2a ( (PGF2a) ; Yankey et al., Expression of the antiviral protein Mx in peripheral blood mononuclear cells of pregnant and bred, non-pregnant ewes. Journal of Endocrinology 170, R7-R11 (2001) ; Bazer et al., Regulation of endometrial responsiveness to estrogen and progesterone by pregnancy recognition signals during the peri-implantation period. In Molecular and Cellular Aspects of Peri-implantation Processes, pp 27-47. Ed S.K. Dey. Springer-Verlag, New York, Inc. (1995) ) . Esto contrasta con el reconocimiento de la gestación en los primates, que implica un efecto luteotrófico directo del cuerpo lúteo (CL) por parte de la gonadotropina coriónica producida por el embrión (Bazer et al. 1995) . La señal para el reconocimiento maternal en ungulados es la secreción por parte del embrión de interferón tau (INFΤ) durante la segunda y la tercera semana de gestación (Bazer et al., 1995; Godkin et al., J. Reprod. Fert. 65:141-150 (1982) ) . El IFNΤ impide el incremento de los receptores endometriales de oxitocina y estrógeno, para anular los pulsos luteolíticos de PGF2a inducidos por oxitocina, y mantiene la función del CL (Spencer et al., Endocrinology 136:4 932-4 94 4 (1995) ) .

El IFNτ es un miembro de la familia del IFN tipo I, que también incluye IFN α, β, y ω (Samuel, Virology 183: 1-11 (1991) ) , y, más recientemente, interferón δ (Lefevre, F., et al., Biochimie 80:779-788 (1998) . La señalización de IFNτ a través del receptor de IFN de tipo I y de la vía de transducción de la señal del transductor de señal de janus quinasa (JAK) y activador de trascripción (STAT) (Stewart et al., Endocrinology 142:98-107 (2001) ) produce una serie de genes en el útero ovino, incluyendo la 2’-5’ oligo adenilato sintetasa (Johnson et al., Biol. Reprod. 64:13921399 (2001) ) , β2-microglobulina (Vallet et al., J. Endocrinol. 130:R1-4 (1991) ) , factor regulador de IFN 1 (Spencer et al., 1998) , la proteína ubiquitina de reacción cruzada (Johnson et al., Biol. Reprod. 62:622-627 (2000) ) , y la proteína Mx (Charleston and Stewart, Gene 137:327-331 (1993) ; Ott et al., Biol. Reprod. 59:784-794 (1998) ) . A pesar de que las funciones de muchas de estas proteínas en la respuesta antiviral están bien caracterizadas, no ocurre lo mismo con sus funciones durante la gestación temprana.

Las proteínas Mx son GTPasas monoméricas, que, dependiendo de la especie del animal y del tipo de virus, son potentes inhibidores de la replicación viral (Samuel, Virology 183:1-11 (1991) ) . Las secuencias de proteínas Mx de diversas especies, incluyendo el ovino, bovino, porcino y equino, están a disposición del público en GenBank y tienen asignados los números de acceso GenBank X66093, U88329, M65087, y U55216, respectivamente. A pesar de que, por lo general, los efectos antivirales de Mx están dirigidos contra virus de ARN de cadena negativa (por ejemplo, ortomixovirus) , su expresión es inducida en todas las células que poseen receptores de IFN de tipo I y ha sido empleada para distinguir entre la infección bacteriana y la viral (Haller et al., Rev. Sci. Tech. 17:220-230 (1998) ) . Recientemente se ha demostrado que los niveles de proteína y ARNm de Mx se elevan desde el epitelio (para el día 13) hasta el miometrio (para el día 15) en la pared uterina de las ovejas preñadas y que estos niveles se mantienen elevados hasta el día 25 (Ott et al., Biol. Reprod. 59:784-794 (1998) ) . Por otra parte, los niveles de ARNm de Mx se incrementaron en el cuerpo lúteo en respuesta a las inyecciones de roIFNx en el lumen uterino (Spencer et al., Biol Reprod 61:464-470 (1999) ) .

Estos resultados indicaron que el IFNT estaba: 1) actuando directamente sobre todos los tipos de células uterinas (es decir, epiteliales, estromales y miometriales) y sobre el CL; o 2) produciendo sustancias (citoquinas) que tienen efectos paracrinos/endocrinos sobre las células uterinas y otros órganos entre los que se incluyen los ovarios; o 3) afectando a componentes de los sistemas inmunitarios circulantes y las mucosas uterinas, que posteriormente afectan a las diversas células uterinas y al CL.

No obstante, resulta poco factible medir el nivel de proteína Mx en el tejido uterino como prueba para evaluar el estado de gestación. Además de resultar un proceso invasivo, que requiere mucho tiempo y trabajo, la alteración de los tejidos uterinos necesaria para determinar los niveles uterinos de Mx tendería a tener un efecto perjudicial sobre la gestación.

Existe una necesidad importante de un método fiable, reproducible y no invasivo para determinar la gestación o la ausencia de gestación en el ganado doméstico.

Resumen de la invención La invención se define en las reivindicaciones.

Se ha descubierto que la expresión de los genes que codifican varias proteínas, en adelante denominadas «proteínas inducidas por la gestación», incluyendo la 2'-5' oligoadenilato sintetasa, β2-microglobulina, el factor regulador de IFN 1, la proteína ubiquitina de reacción cruzada y la proteína Mx, se incrementa de forma significativa en determinados animales durante el primer mes de la gestación. También se ha descubierto que el incremento de la expresión de las proteínas inducidas por la gestación no se produce en los animales que no están preñados.

En muchos animales, el aumento de la expresión de la proteína inducida por la gestación se debe a la secreción de una hormona, el interferón de tipo I, por parte del embrión, que es la señal del embrión que indica su existencia a la madre, denominada la señal del reconocimiento maternal de la gestación. Los diferentes interferones de tipo 1, incluyendo el interferón alfa (IFNa) , interferón beta (IFNβ) , interferón omega (IFNω) , interferón delta (IFNδ) , e interferón tau (IFNT) , son secretados por los embriones de las diferentes especies. Por ejemplo, el IFNT es secretado como una hormona de reconocimiento de la gestación en los rumiantes y el IFNδ es secretado por el ganado porcino. En otras especies, como caballos y otros équidos, a pesar de que la proteína inducida por la gestación Mx se puede detectar en el útero durante la gestación temprana, hasta la fecha no... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar el estado de gestación en un animal ungulado rumiante o no rumiante, así como en un animal rumiante sin pezuña, que comprende, por una parte, la determinación del nivel de expresión extrauterina de una proteína inducida por la gestación seleccionada del grupo compuesto po.

2. 5' oligoadenilato sintetasa, proteína ubiquitina de reacción cruzada y proteína Mx en un fluido corporal recogido del animal durante los 12-30 días siguientes a la fecundación y, por otra, la comparación del nivel de expresión de la mencionada proteína en el animal con el de un animal no preñado de la misma especie.

2. El método de la reivindicación 1 donde el animal es un rumiante.

3. El método de la reivindicación 2 donde el rumiante se selecciona del grupo compuesto por el camello bactriano, el 15 dromedario, la llama, la alpaca y la vicuña.

4. El método de la reivindicación 2 donde el animal es un ungulado.

5. El método de la reivindicación 1 donde el animal se selecciona del grupo compuesto por la vaca, la oveja, la 20 cabra, el yak, el búfalo de agua, el bisonte, el antílope y el ciervo.

6. El método de la reivindicación 5 donde el animal es una oveja o una vaca.

7. El método de la reivindicación 1 donde el animal es un ungulado.

8. El método de la reivindicación 7 donde el animal es un cerdo.

9. El método de la reivindicación 1 donde la proteína es una proteína Mx.

10. El método de la reivindicación 1 donde el nivel de expresión de la proteína se determina estableciendo el nivel de codificación de ARNm para la proteína.

11. El método de la reivindicación 10 donde la determinación del ARNm se realiza mediante un análisis Northern blot, un análisis slot-blot o una reacción en cadena de polimerasa.

12. El método de la reivindicación 1 donde el nivel de expresión de la proteína se determina estableciendo el nivel de la proteína.

13. El método de la reivindicación 12 donde la determinación del nivel de producción de la proteína se consigue 40 evaluando la unión de un anticuerpo a la proteína o mediante un ensayo basado en una función de la proteína.

14. El método de la reivindicación 12, donde el nivel de producción de la proteína se detecta mediante un ensayo colorimétrico.

15. El método de la reivindicación 1 donde el nivel de expresión de la proteína se determina estableciendo la expresión de la proteína en una célula del animal.

16. El método de la reivindicación 15 donde la célula es una célula sanguínea nucleada.

17. El método de la reivindicación 16 donde la célula es una célula mononuclear de la sangre periférica.

18. El método de la reivindicación 1 donde el fluido corporal se selecciona del grupo compuesto por leche, saliva, orina, secreciones nasales, oculares o vaginales.

19. El método de la reivindicación 1 donde el fluido corporal es sangre, plasma o suero.

20. El método de la reivindicación 1 donde se determina que el animal no está preñado si el nivel de expresión de la proteína en el animal no es elevado en comparación con el nivel de expresión de la proteína en un animal no preñado de la misma especie.

21. El método de la reivindicación 1 donde se determina que el animal está preñado si el nivel de expresión de la proteína en el animal es el doble al menos que el nivel de expresión de la proteína en un animal no preñado de la misma especie.

22. El método de la reivindicación 21 donde se determina que el animal está preñado si el nivel de expresión de la proteína en el animal es el cuádruple al menos que el nivel de expresión de la proteína en un animal no preñado de la misma especie.

23. El método de la reivindicación 1 donde la comparación es una comparación paralela del nivel de expresión de la proteína en el animal y el nivel de expresión en un animal que se sabe que está preñado o que no está preñado.

24. El método de la reivindicación 1 donde la comparación se realiza utilizando un control histórico.

25. El método de la reivindicación 1 que se realiza durante el período de los 15-30 días siguientes a la fecundación del animal.

26. El método de la reivindicación 25 que se realiza durante el período de los 12-21 días siguientes a la fecundación del animal.

27. El método de la reivindicación 26 que se realiza durante el período de los 18-21 días siguientes a la fecundación del animal.