Detección rápida de células en replicación.

Un método para detectar células diana vivas en una muestra, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) proporcionar células diana vivas presentes en dicha muestra en una zona de detección que comprende un área de detección a una densidad inferior a 100 células diana por mm2 del área de detección, en el que dentro de dicha zona de detección dichas células están dispersadas e inmovilizadas al azar;

(b) permitir la formación de una o más microcolonias de dichas células diana mediante replicación in situ;

(c) marcar dichas una o más microcolonias con un reactivo de marcaje; y

(d) detectar dichas una o más microcolonias detectando la señal generada mediante dicho reactivo de marcaje; en el que la dimensión lineal más larga de dicha área de detección es mayor de 1 mm; dichas una o más microcolonias tienen una medida media inferior a 50 micras en al menos dos dimensiones ortogonales; en el que dicha detección no supone un aumento de más de 5x; en el que dichas células en dichas una o más microcolonias siguen siendo competentes para replicarse tras dicha detección; y en el que dicho método de detección no emplea barrido láser.

Detección rápida de células en replicación

Antecedentes de la invención La invención se refiere a la detección, enumeración e identificación de células en replicación, especialmente células microbianas (por ejemplo, bacterias, levaduras y mohos) , en muestras médicas, industriales y medioambientales. El cultivo microbiano es la metodología predominante en estos mercados, debido a sus muchas características atractivas. La invención aborda la desventaja principal del cultivo microbiano (el periodo de tiempo necesario para lograr resultados) mientras que conserva los atributos beneficiosos del método.

Cultivo microbiano para detectar y enumerar microbios Durante los siglos XIX y XX, surgió una comprensión referente al papel de las bacterias, levaduras y mohos en la producción de enfermedades infecciosas y en la determinación de la calidad de alimentos y bebidas. Al principio, se desarrolló un método potente, el cultivo microbiano, para detectar pequeños números de microbios. El cultivo microbiano permite una detección visual sencilla de microbios aprovechándose de su propensión a reproducirse en grandes números rápidamente. Por ejemplo, una única célula bacteriana, que es demasiado pequeña para verse a simple vista (aproximadamente una millonésima de un metro) , cuando se coloca en caldo nutritivo, puede hacer que el caldo se vuelva visiblemente turbio en menos de 24 horas.

Los documentos de la técnica anterior a modo de ejemplo relacionados con la invención pueden resumirse tal como sigue:

Vidon D.J. et al., Journal of applied microbiology, vol. 90, n.º 6, junio de 2001, páginas 988-993, proporcionan un método basado en quimioluminiscencia simple para la enumeración rápida de microcolonias de Listeria spp.

Nelis H. et al., Water air and soil pollution, vol. 123, n.º 1-4, octubre de 2000, páginas 43-52, dan a conocer la detección enzimática de coliformes y Escherichia coli en el plazo de cuatro horas.

Van Poucke S.O. et al., Journal of microbiological methods, vol. 42, n.º 3, noviembre de 2000, páginas 233-244, dan a conocer la detección rápida de Escherichia coli y coliformes totales fluorescentes y quimioluminiscentes en filtros de membrana.

Además, Van Poucke S.O. et al., Journal of applied microbiology, vol. 89, n.º 3, septiembre de 2000 (09-2000) , páginas 390-396, dan a conocer una prueba de citometría en fase sólida de 210 min. para la enumeración de Escherichia coli en agua potable.

Además, Kroll R.G. et al., Journal of applied bacteriology, vol. 66, n.º 2, 1989, páginas 161-168, proporcionan un método de recuento de pulso de luz láser para el recuento automático y sensible de bacterias teñidas con naranja de acridina.

Adicionalmente, Van Poucke S.O. et al., Water supply 1999 GB, vol. 17, n.º 2, 1999, páginas 67-72, dan a conocer la detección enzimática basada en citometría en fase sólida de coliformes en agua potable en el plazo de 4 horas.

Una técnica de cultivo microbiano relacionada, denominada enumeración microbiana o recuento de colonias, cuantifica el número de células microbianas en una muestra. El método de enumeración microbiana, que se basa en la replicación microbiana in situ, proporciona generalmente una “colonia” detectable visualmente para cada célula microbiana en la muestra. Por tanto, el recuento de colonias visibles permite a los microbiólogos determinar el número de células microbianas en una muestra de manera precisa. Para realizar la enumeración microbiana, las células bacterianas pueden dispersarse sobre la superficie de agar nutritivo en placas de Petri (“placas de agar”) e incubarse en condiciones que permiten la replicación bacteriana in situ. Los microbios individuales, visualmente indetectables, se replican repetidamente para crear un gran número de microbios hijos idénticos en el sitio físico en el que se depositó la célula microbiana progenitora. Las células hijas permanecen colocalizadas (esencialmente contiguas) con la célula original, de modo que la cohorte de células hijas (que puede crecer hasta decenas o centenas de millones de células) forma finalmente una colonia visible sobre la placa.

Se han desarrollado métodos electrónicos para enumerar colonias microbianas. La mayoría de tales métodos automatizan el recuento de colonias pero no aumentan sustancialmente la sensibilidad ni disminuyen el tiempo hasta conseguir resultados en comparación con la enumeración tradicional a simple vista. Los contadores de colonias usan una variedad de métodos ópticos para detectar colonias incluyendo la detección de propiedades ópticas intrínsecas de las microcolonias (por ejemplo, patente estadounidense n.º: 3.493.772; patente estadounidense n.º: 3.811.036; patente estadounidense n.º: 5.290.701; Arkin, A. P., et al. (1990) ; Biotechnology (N Y) 8: 746-9) y cambios de color de moléculas indicadoras del pH en la matriz que rodea a las colonias (patente estadounidense n.º 5.510.246) . También se han desarrollado métodos que usan tinciones o sondas para marcar las colonias y se tratarán más adelante.

El cultivo microbiano es un método extraordinariamente satisfactorio, tal como se evidencia por el hecho de que incluso tras más de un siglo, el método predomina todavía en microbiología médica y en las pruebas de control de calidad en microbiología industrial (por ejemplo, fabricación de productos farmacéuticos, alimentos y bebidas) . El método es económico, relativamente sencillo y ultrasensible. La sensibilidad del cultivo microbiano puede observarse en la prueba común para patógenos transmitidos por alimentos en carne picada. Puede detectarse una única célula patógena bacteriana microscópica en 25 gramos de carne picada usando el cultivo microbiano. Otra ventaja del cultivo microbiano es su capacidad para detectar una gran variedad de microbios de importancia médica e industrial.

Una ventaja de la replicación bacteriana in situ es la capacidad para generar una población de células pura, o clonal (denominada cultivos puros, clones o colonias) . Un cultivo puro es una gran colección de células vivas idénticas que 10 desciende de la misma célula progenitora. Se requieren cultivos puros para métodos que identifican microbios y para determinar la resistencia a antibióticos. La microbiología médica se basa en gran medida en cultivos puros, dado que los patógenos bacterianos se aíslan frecuentemente de muestras clínicas no estériles (por ejemplo, heces o heridas) junto con bacterias no patógenas que probablemente son incluso más numerosas que la célula patógena. El aislamiento de cultivos microbianos puros es también importante en microbiología industrial. Por ejemplo, los fabricantes de productos farmacéuticos y cosméticos deben someter a prueba sus productos para detectar la presencia de contaminantes microbianos. Se usan cultivos puros de los microbios contaminantes para la identificación microbiana, lo que determina si un lote de producción debe desecharse y ayuda en la investigación de la fuente de la contaminación en el proceso industrial.

Enumeración microbiana usando cultivo microbiano Ventajas

• ultrasensible

• cuantitativa

• genera cultivos puros

• puede detectar y enumerar muchos tipos de microbios en una única prueba

• puede hacer crecer microbios selectivamente

• sólo detecta células en replicación

• económica

• sencilla y fácil de realizar

Desventajas

• lenta

• análisis y procedimientos manuales

• no todos los microbios pueden cultivarse

Tabla 1.

La capacidad para cultivar microbios selectivamente es una herramienta esencial para la identificación microbiana y para determinar la resistencia y la sensibilidad a agentes antimicrobianos tales como antibióticos. El cultivo selectivo se aprovecha del hecho de que diferentes microbios requieren diferentes condiciones de crecimiento. Estas diferencias surgen del hecho de que las cepas de microbios difieren en su composición bioquímica debido a diferencias genéticas inherentes. Por ejemplo, un tipo de microbio podría ser capaz de crecer en medio nutritivo que contiene el azúcar sorbitol como única fuente de átomos de carbono para impulsar su crecimiento, mientras que otro tipo de microbio no puede hacerlo. El crecimiento selectivo es importante en la industria alimentaria. Por ejemplo, puede explorarse una muestra de alimento para detectar un patógeno alimentario particular, Salmonella, sembrando en placa la muestra sobre medios que permiten que crezca Salmonella pero no otros microbios alimentarios.

De manera similar, se usa el cultivo selectivo... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar células diana vivas en una muestra, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) proporcionar células diana vivas presentes en dicha muestra en una zona de detección que comprende un área de detección a una densidad inferior a 100 células diana por mm2 del área de detección, en el que dentro de dicha zona de detección dichas células están dispersadas e inmovilizadas al azar;

(b) permitir la formación de una o más microcolonias de dichas células diana mediante replicación in situ;

(c) marcar dichas una o más microcolonias con un reactivo de marcaje; y

(d) detectar dichas una o más microcolonias detectando la señal generada mediante dicho reactivo de marcaje;

en el que la dimensión lineal más larga de dicha área de detección es mayor de 1 mm; dichas una o más microcolonias tienen una medida media inferior a 50 micras en al menos dos dimensiones ortogonales; en el que dicha detección no supone un aumento de más de 5x; en el que dichas células en dichas una o más microcolonias siguen siendo competentes para replicarse tras dicha detección; y en el que dicho método de detección no emplea barrido láser.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dichas células diana están dispersadas al azar en una zona de detección a una densidad inferior a 1 célula diana por mm2 del área de detección.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicha detección detecta una única microcolonia en el área de detección.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dichas células diana son células bacterianas o eucariotas, en particular células de los hongos, animales o vegetales.

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicha muestra se obtiene mediante muestreo de aire o agua medioambiental, o de superficies, objetos u organismos expuestos al medioambiente, o dicha muestra se obtiene de un material seleccionado del grupo que consiste en material de partida, terminado o en proceso en la fabricación de productos farmacológicos, cosméticos, sanguíneos u otros para uso tópico o interno en seres humanos o animales; material de partida, en proceso o terminado en la fabricación de alimentos o bebidas; material de partida, en proceso o terminado en la fabricación de dispositivos médicos o de diagnóstico in vitro, productos químicos; superficies industriales; instrumentación; y maquinaria.

6. El método de la reivindicación 1, en el que dicha zona de detección comprende un material seleccionado del grupo que consiste en vidrio, plástico, membranas absorbentes, o tiras de plástico.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la replicación de dichas células en dichas microcolonias se continúa tras dicha detección.

8. El método de la reivindicación 1, en el que dicha detección comprende iluminar una o más microcolonias para generar una señal detectable, por ejemplo, fluorescencia.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicha iluminación emplea uno o más láseres o diodos emisores de luz o una fuente de luz blanca.

10. El método de la reivindicación 1, en el que dicho reactivo de marcaje se une a constituyentes moleculares de dichas células diana, en particular, una tinción para detectar actividad enzimática, tal como una tinción de esterasa fluorógena.

11. El método de la reivindicación 1, en el que dicho reactivo de marcaje se añade a medios nutritivos de modo que dichas células diana se exponen a dicho reactivo de marcaje durante el crecimiento.

12. El método de la reivindicación 11, en el que dicha detección emplea filtros ópticos adaptados para detectar la señal que proviene de la iluminación de dichas células diana.

13. El método de la reivindicación 1, en el que dicha detección emplea un detector fotoeléctrico, en particular un detector de matriz fotoeléctrica.

14. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa, durante o tras la etapa (d) , de cuantificar el número de microcolonias.

15. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa, durante o tras la etapa (d) , de detectar las microcolonias que crecen a lo largo del tiempo.