Desaturasas y proceso para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos.

Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste de:

(a) secuencia de ácidos nucleicos como se muestra en la SEQ ID NO. 1 o 2, y;

(b) secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que caracteriza una secuencia deaminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO. 3; y

(c) secuencia de ácidos nucleicos que tiene por lo menos 70% de identidad con la longitud completa de unade las secuencias de ácidos nucleicos de (a) o (b), y que codifica un polipéptido con una actividad de ω3-desaturasa, en donde dicha secuencia de ácidos nucleicos comprende un secuencia que codifica lasecuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47, en donde en la posición 16 de la SEQ ID NO: 47 estápresente un residuo de Histidina.

Desaturasas y proceso para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos La presente invención se relaciona con polinucleótidos de Cochliobolus heterostrophus C5, Cianothece sp. CCY0110, Mycocentrospora acerina y Hyaloperonospora parasitica, que codifican desaturasas y que se pueden emplear para la producción recombinante de ácidos grasos poliinsaturados. La invención adicionalmente se relaciona con vectores, células anfitrionas y organismos no humanos transgénicos que comprenden los polinucleótidos de acuerdo con la invención, y con los polipéptidos codificados por los polinucleótidos. La invención adicionalmente se relaciona con anticuerpos contra los polipéptidos de acuerdo con la invención. Finalmente, la invención también se relaciona con procesos de producción para los ácidos grasos poliinsaturados y para composiciones de aceite, lípido y ácido graso y con su uso como fármacos, cosméticos, alimentos, comida para animales, preferiblemente comida para peces, o suplementos alimenticios.

Los ácidos grasos y triacilglicéridos tienen una multiplicidad de aplicaciones en la industria alimenticia, en la nutrición animal, en cosméticos y en el sector farmacológico. Dependiendo de si son ácidos grasos insaturados o saturados libres o también triacilglicéridos con un contenido elevado de ácidos grasos saturados o insaturados, son adecuados para muchas aplicaciones diferentes. Los ácidos grasos poliinsaturados tales como ácido linoleico y ácido linolénico son esencialmente para mamíferos, ya que estos últimos no lo producen por si mismos. Por lo tanto los ácidos w3grasos y w6-grasos poliinsaturados son un constituyente importante en la nutrición animal y humana.

Los ácidos w3-grasos de cadena larga poliinsaturados tales como ácido eicosapentaenoico (= EPA, C20:5M5, 8, 11, 14, 17)

o ácido docosahexaenoico (= DHA, C22:6M4, 7, 10, 13, 16, 19) son importantes componentes en la nutrición humana debido a sus diversas funciones en los aspectos de salud, que incluyen el desarrollo del cerebro del niño, la funcionalidad de los ojos, la síntesis de hormonas y otras sustancias de señal, y la prevención de trastornos cardiovasculares, cáncer y diabetes (Poulos, A Lípidos 30:1-14, 1995; Horrocks, LA and Yeo YK Pharmacol Res 40:211-225, 1999) . Esto es por qué hay una demanda de la producción de ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados.

Los ácidos w3-grasos, que se encuentran preferiblemente en aceites de pescado, al alimento es particularmente importante. Por lo tanto, por ejemplo, los ácidos grasos poliinsaturados tales como ácido docosahexaenoico (= DHA, C22:6M4, 7, 10, 13, 16, 19) o ácido eicosapentaenoico (= EPA, C20:5M5, 8, 11, 14, 17) se agrega a fórmula para bebes para mejorar el valor nutricional. Se dice que el ácido graso insaturado DHA tiene un efecto positivo sobre el desarrollo y mantenimiento de funciones cerebrales.

Aquí adelante, ácidos grasos poliinsaturados se refieren como PUFA, PUFAs, LCPUFA o LCPUFAs (ácidos grasos poliinsaturados, PUFA, ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga, LCPUFA) .

Los varios ácidos grasos y triglicéridos se obtienen principalmente a partir de microorganismos tales como Mortierella y Schizochytrium o a partir de plantas que producen aceite tales como soya, colza, algas tal como Cr y pthecodinium o Phaeodactylum y otros organismos, donde se obtienen, como una regla, en la forma de sus triacilglicéridos (= triglicéridos = trigliceroles) . Sin embargo, también se obtienen de animales, tales como, por ejemplo, pescado. Los ácidos grasos libres se preparan ventajosamente mediante hidrólisis. Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena muy larga tales como DHA, EPA, ácido araquidónico (= ARA, C20:4M5, 8, 11, 14) , ácido dihomo-y-linolénico (C20:3M8, 11, 14) o ácido docosapentaenoico (DPA, C22:5M7, 10, 13, 16, 19) no se sintetizan en cultivos de aceite tales como colza, soya, girasol o cártamo. Las fuentes naturales convencionales de estos de estos ácidos grasos son pescado tal como arenque, salmón, sardinas, gallineta nórdica, anguila, carpa, trucha, mero, caballa, lucioperca o atún, o algas.

Dependiendo del uso destinado, se prefieren los aceites con ácidos grasos saturados o insaturados. En la nutrición humana, por ejemplo, lípidos con ácidos grasos insaturados, específicamente se prefieren los ácidos grasos poliinsaturados. Se dice que los ácidos w3-grasos poliinsaturados tienen un efecto positivo sobre el niel de colesterol en la sangre y por lo tanto en la posibilidad de evitar enfermedades cardiacas. Se puede reducir notablemente el riesgo de enfermedad cardiaca, una apoplejía o hipertensión al agregar estos ácidos w3-grasos al alimento. También, los ácidos w3-grasos tienen un efecto positivo en enfermedades inflamatorias, específicamente sobre en enfermedades crónicamente inflamatorias, procesos en asociación con enfermedades inmunológicas tales como artritis reumatoide. Por lo tanto se agregan a los alimentos, específicamente a alimentos ddietéticos, o se emplean en medicamentos. Los ácidos w6-grasos tales como ácido araquidónico tienden a tener un efecto negativo sobre estos trastornos en relación con enfermedades reumáticas por cuenta de nuestro consumo dietético usual.

Los ácidos w3- y w6-grasos son precursores de las hormonas de tejidos, conocidas como eicosanoides, tales como las prostaglandinas, que son derivadas de ácido dihomo-y-linolénico, ácido araquidónico y ácido eicosapentaenoico, y de los tromboxanos y leucotrienos, que se derivan de ácido araquidónico y ácido eicosapentaenoico. Los eicosanoides que se forman a partir de ácidos w6-grasos (conocidos como la serie PG2) generalmente promueven las reacciones inflamatorias, mientras que los eicosanoides de ácidos w3-grasos (conocidos como la serie PG3) tienen poco o no tienen efecto proinflamatorio.

Debido a sus características positivas, no han faltado intentos en el pasado para hacer disponibles los genes que están implicados en la síntesis de ácidos grasos o triglicéridos para la producción de aceites en diversos organismos con un contenido modificado de ácidos grasos insaturados. Así, el documento WO 91/13972 y su equivalente Estadounidense describe una M9-desaturasa. El documento WO 93/11245 reivindica una M15-desaturasa y el documento WO 94/11516 una M12-desaturasa. Se describen desaturasas adicionales, por ejemplo, en los documentos EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 o Huang et al., Lípidos 34, 1999: 649-659. Sin embargo, la caracterización bioquímica de las diversas desaturasas hasta la fecha ha sido insuficiente debido a que las enzimas, que son proteínas unidas a membranas, presentan gran dificultad en su aislamiento y y caracterización (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792) . Como una regla, las desaturasas unidas a membrana se caracterizan por estar introducidas en un organismo adecuado que posteriormente se analiza para actividad de enzima al analizar los materiales de partida y los productos. Se describen las M6-Desaturasas en los documentos WO 93/06712, US 5, 614, 393, WO 96/21022, WO 00/21557 y WO 99/27111. Su aplicación para la producción en organismos transgénicos se describe, por ejemplo, en los documentos WO 98/46763, WO 98/46764 y WO 98/46765. En este contexto, también se describe y reivindica la expresión de diversas desaturasas y la formación de ácidos grasos poliinsaturados; véase, por ejemplo, los documentos WO 99/64616 o WO 98/46776. En cuanto a la eficacia de la expresión de las desaturasas y su efecto sobre la formación de ácidos grasos poliinsaturados, se debe notar que la expresión de una única desaturasa como se describe a la fecha solo ha resultado en contenidos bajos de ácidos grasos insaturados/lípidos tales como, por ejemplo, ácido y-linolénico y ácido estearidónico. Más aún, s como una regla, se obtiene una mezcla de ácidos w3- y w6-grasos.

Los microorganismos especialmente adecuados para la producción de PUFAs son microalgas tales como Phaeodactylum tricornutum, Porphiridium species, Thraustochytrium species, Schizochytrium species o Cr y pthecodinium species, ciliados tales como Stylonychia o Colpidium, hongos tales como Mortierella, Entomoftora o Mucor y/o musgos tales como Physcomitrella, preferiblemente Physcomitrella patens, Ceratodon y Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22: 1060-1062; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistr y and Biotechnology 73: 269-278) . La selección de cepa ha resultado en el desarrollo de un número... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste de:

(a) secuencia de ácidos nucleicos como se muestra en la SEQ ID NO. 1 o 2, y;

(b) secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que caracteriza una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO. 3; y

(c) secuencia de ácidos nucleicos que tiene por lo menos 70% de identidad con la longitud completa de una de las secuencias de ácidos nucleicos de (a) o (b) , y que codifica un polipéptido con una actividad de w3desaturasa, en donde dicha secuencia de ácidos nucleicos comprende un secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47, en donde en la posición 16 de la SEQ ID NO: 47 está presente un residuo de Histidina.

2. El polinucleótido de acuerdo con reivindicación 1, en donde el polinucleótido consiste de ARN o ADN.

3. Un vector que comprende el polinucleótido de acuerdo con reivindicación 1 o 2.

4. El vector de acuerdo con reivindicación 3, en donde el vector es un vector de expresión.

5. El vector de acuerdo con reivindicación 3 o 4, en donde el vector comprende por lo menos un polinucleótido adicional que codifica una enzima adicional que está involucrada en la biosíntesis de lípidos o ácidos grasos.

6. Una célula anfitriona que comprende el polinucleótido de acuerdo con reivindicación 1 o 2 o el vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

7. La célula anfitriona de acuerdo con reivindicación 6, en donde la célula anfitriona adicionalmente comprende por lo menos una enzima adicional que está involucrada en la biosíntesis de lípidos o ácidos grasos.

8. El vector de acuerdo con reivindicación 5 o la célula anfitriona de acuerdo con reivindicación 7, en donde la enzima se selecciona del grupo que consiste de: acil-CoA de hidrogenasa, acil-ACP [= proteína portadora de acilo] desaturasa, acil-ACP tiesterasa, ácido graso aciltransferasa, acil-CoA:lisofosfolíido aciltransferasa, ácido graso sintasa, ácido graso hidroxilasa, acetil-coenzima A carboxilasa, acil-coenzima A oxidasa, ácido graso desaturasa, ácido graso acetilenasa, lipoxigenasa, triacilglicerol lipasa, óxido de aleno sintasa, hidroperóxido liasa, ácido graso elongasa, M4-desaturasa, M5-desaturasa, M6-desaturasa, M8-desaturasa, M9-desaturasa, M12- desaturasa, M5elongasa, M6-elongasa y M9-elongasa.

9. Un método para generar un polipéptido con actividad de desaturasa, que comprende las etapas:

(a) expresar un polinucleótido de acuerdo con reivindicación 1 o 2 en una célula anfitriona; y

(b) obtener, de la célula anfitriona, el polipéptido que se codifica por el polinucleótido de acuerdo con (a) .

10. Un polipéptido que se codifica por el polinucleótido de acuerdo con reivindicación 1 o 2 o que se puede obtener mediante el método de acuerdo con reivindicación 9.

11. Un anticuerpo que reconoce específicamente el polipéptido de acuerdo con reivindicación 10.

12. Un organismo transgénico, no humano que comprende el polinucleótido de acuerdo con reivindicación 1 o 2, el vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 o la célula anfitriona de acuerdo con reivindicación 6

o 7.

13. El organismo transgénico, no humano de acuerdo con reivindicación 12, en donde el organismo es un animal, una planta o un microorganismo multicelular.

14. Un proceso para la producción de una sustancia que tiene la estructura mostrada en la fórmula I adelante

en donde las variables y sustituyentes son como sigue:

R1 = hidroxilo, coenzima A (tiéster) , lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilglicerol, lisodifosfatidilglicerol, lisofosfatidilserina, lisofosfatidilinositol, base de esfingo o un radical de la fórmula II

R2 = hidrógeno, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, difosfatidilglicerol, fosfatidilserina, fosfatidilinositol o alquilcarbonilo C2 a C24 saturado o insaturado,

R3 = hidrógeno, un alquilcarbonilo saturado o insaturado C2 a C24, o R2 y R3 independientemente de otro son un radical de la fórmula Ia:

n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 9, m = 2, 3, 4, 5 o 6 y p = 0 o 3; y en donde el proceso comprende el cultivo de (i) una célula anfitriona de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 o (ii) de un organismo transgénico o humano de acuerdo con reivindicación 12 o 13 bajo condiciones que permiten la biosíntesis de la sustancia.

15. Un proceso para la producción de un aceite, lípido o composición de ácido graso, que comprende las etapas del

proceso de acuerdo con reivindicación 14 y la etapa adicional de formular la sustancia como un aceite, lípido o composición de ácido graso.

16. El proceso de acuerdo con reivindicación 15, en donde el aceite, lípido o composición de ácido graso se formula adicionalmente para dar un fármaco, un producto cosmético, un alimento, una comida para animales, preferiblemente comida para peces, o un suplemento alimenticio.

17. El uso de el polinucleótido de acuerdo con reivindicación 1 o 2, del vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, de la célula anfitriona de acuerdo con reivindicación 6 o 7, del vector o la célula anfitriona de acuerdo con reivindicación 8, del polipéptido de acuerdo con reivindicación 10 o del organismo transgénico, no humano de acuerdo con reivindicación 12 o 13 para la producción de un aceite, lípido o composición de ácido graso.

18. El uso de acuerdo con reivindicación 17, en donde el aceite, lípido o composición de ácido graso es para ser

empleado como un fármaco, un producto cosmético, un alimento, una comida para animales, preferiblemente comida para peces, o un suplemento alimenticio.