CULTIVO BIOLÓGICO DE UNA CEPA DE LA ESPECIE Pseudomonas graminis, USO DE DICHO CULTIVO COMO ANTAGONISTA Y METODO PARA TRATAR FRUTA.

Cultivo biológico de una cepa de la especie Pseudomonas graminis,

uso de dicho cultivo como antagonista para el control biológico de bacterias patógenas, y método para tratar fruta que comprende la etapa de aplicar a la fruta una preparación que comprende dicho cultivo.

Cultivo biológico sustancialmente puro de una cepa de la especie Pseudomonas graminis, depositada con el número CBS124167 en la institución de depósito "Centraalbureau voor Schimmelcultures" (CBS) de Utrech, Holanda. Uso del cultivo CBS124167 como antagonista para el control biológico de bacterias patógenas de transmisión alimentaria en fruta para consumo humano. Método para tratar fruta que comprende la etapa de aplicar a la fruta una preparación que comprende un cultivo de una cepa de la especie Pseudomonas graminis, depositada con el número CBS124167 en la institución de depósito "Centraalbureau voor Schimmelcultures" (CBS) de Utrech, Holanda. Su aplicación permite reducir el crecimiento de los patógenos durante la vida útil del producto, especialmente cuando se rompe la cadena de frío.

Cultivo biológico de una cepa de la especie Pseudomonas graminis, uso de dicho cultivo como antagonista para el control biológico de bacterias patógenas, y método para tratar fruta que comprende la etapa de aplicar a la fruta una preparación que comprende dicho cultivo La presente invención se refiere a un cultivo biológico de una cepa de la especie Pseudomonas graminis y a la utilización de dicha cepa como antagonista para el control biológico de bacterias patógenas de transmisión alimentaria en fruta. También se refiere a un método para tratar fruta que comprende la etapa de aplicar a la fruta una preparación que comprende dicho cultivo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La fruta fresca cortada o fruta de cuarta gama es un producto de reciente aparición en los mercados. Esta fruta es sometida a un procesado mínimo consistente en la limpieza, pelado, corte, desinfección y envasado en atmósfera modificada pasiva o activa, conservándose finalmente en condiciones de refrigeración.

La fruta cortada es un producto alimenticio muy susceptible a alteraciones físicas, químicas y biológicas, que se deteriora a mayor velocidad que las piezas enteras. En la fruta cortada la respiración y los procesos metabólicos se aceleran como resultado de la manipulación, por lo que resulta esencial conservar el producto en atmósfera modificada y mantenerlo en condiciones de refrigeración.

La reglamentación actual aplica unos criterios microbiológicos muy estrictos a la fruta cortada con el objetivo de reducir al mínimo las toxiinfecciones alimentarias o enfermedades originadas por la ingesta de fruta contaminada con bacterias del tipo Salmonella spp., Listeria spp. o Escherichia coli O157:H7.

En la actualidad, para garantizar la seguridad alimentaria de los productos de cuarta gama resulta habitual aplicar tratamientos consistentes en lavar la fruta con agua adicionada con hipoclorito sódico. Estos tratamientos consiguen reducir la carga microbiana de los productos pero presentan el inconveniente de que pueden dejar un residuo de cloro que facilita la formación de sustancias que podrían tener carácter cancerígeno. Además, el tratamiento con hipoclorito no previene el crecimiento de los microorganismos durante la conservación de la fruta o durante la vida útil del producto.

El control biológico de las bacterias patógenas de transmisión alimentaria en productos de cuarta gama es una alternativa a los tratamientos con hipoclorito sódico que resulta muy deseable. No obstante, para que esta alternativa sea viable resulta imprescindible hallar microorganismos antagonistas que sean efectivos contra cualquiera de los tres tipos de bacterias patógenas citadas (Salmonella spp., Listeria spp., y Escherichia coli O157:H7) , tanto a temperatura ambiente como en condiciones de refrigeración y atmósfera modificada. Además, es deseable que estos antagonistas sean innocuos tanto para los humanos como para los vegetales ya que, en caso contrario, podrían perjudicar al consumidor o al producto tratado.

En el estado de la técnica se han descrito antagonistas para el control biológico de bacterias patógenas de transmisión alimentaria en fruta (“Biological control of postharvest decays of apple can prevent growth of Escherichia coli O157:H7 in apple wounds”, Janisiewicz, W. et al. JOURNAL OF FOOD PROTECTION 62 (12) : 1372-1375. 1999 y “Biocontrol of the food-borne pathogens Listeria monocytogenes and Salmonella enterica serovar Poona on fresh-cut apples with naturally occurring bacterial and yeast antagonists.” Leverentz, B. et al. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY 72 (2) :1135-1140. 2006) .

Sin embargo, los antagonistas empleados no pertenecen a la especie Pseudomonas graminis y, además, ninguno de ellos es efectivo contra cualquiera de los microorganismos Salmonella spp. Listeria spp. y Escherichia coli O157:H7 tanto a temperatura ambiente como en condiciones de refrigeración.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

Un primer objetivo de la presente invención es proporcionar un cultivo biológico sustancialmente puro de una nueva cepa de la especie Pseudomonas graminis depositada con el número CBS124167 en la institución de depósito “Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) de Utrech, Holanda.

Un segundo objetivo es proporcionar un cultivo biológico sustancialmente puro de una nueva cepa de la especie Pseudomonas graminis depositada con el número CBS124167 para su uso como antagonista para el control biológico de bacterias patógenas de transmisión alimentaria en fruta para consumo humano.

Un tercer objetivo de la presente invención consiste en el uso del mencionado cultivo biológico de la nueva cepa como antagonista para el control biológico de bacterias patógenas de transmisión alimentaria en fruta para consumo humano.

Un cuarto objetivo consiste en proporcionar un método para tratar fruta que comprende la etapa de aplicar a la fruta una preparación que comprende el mencionado cultivo biológico de la nueva cepa.

Se ha observado que la nueva cepa aislada muestra una gran efectividad como antagonista frente bacterias patógenas de transmisión alimentaria en fruta, en una amplia gama de patógenos y frutas, a temperatura ambiente, en atmósfera modificada y en condiciones de refrigeración. Su aplicación permite reducir el crecimiento de los patógenos durante la vida útil del producto, especialmente cuando se rompe la cadena de frío.

En la presente invención, por bacterias patógenas de transmisión alimentaria se entenderá bacterias patógenas causantes de toxiinfecciones alimentarias o enfermedades originadas por la ingesta de alimentos contaminados, por ejemplo, fruta contaminada con bacterias patógenas del tipo Salmonella spp., Listeria spp. o Escherichia coli O157:H7.

La nueva cepa de la especie Pseudomonas graminis (Behrendt et al.19991) se aisló de la superficie de una manzana “Golden Delicious” mediante un lavado con agua estéril, seguido de la inmersión en solución de peptona salina (peptona, 1 g/l; NaCl, 0, 85 g/l) , sonicación en un baño de ultrasonidos durante 10 min y siembra del liquido de lavado en medio de cultivo NYDA (Caldo nutritivo, 8 g/l; extracto de levadura, 5 g/l; dextrosa, 10 g/l y agar 15 g/l) y posterior incubación a 25 ºC durante 3 días.

El cultivo de la nueva cepa ha sido depositado por uno de los solicitantes, de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento del depósito de microorganismos para el propósito del procedimiento de patentes, en la autoridad internacional de depósito “Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) ” con domicilio en Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrech, Holanda. El número de depósito asignado ha sido el CBS124167.

El aislado CBS124167 fue identificado mediante secuenciación parcial de la región 16S rRNA: Pseudomonas sp., y mediante secuenciación total de la región 16S rRNA: Pseudomonas graminis (Behrendt et al.19991) .

Características morfológicas y bioquímicas de la nueva cepa La cepa CBS124167 es un bacilo gramnegativo, no formador de esporas, oxidasa negativo y catalasa positivo, móvil y aerobio. En placa, las colonias son amarillas, de forma circular con bordes enteros.

La cepa CBS124167 presenta las características bioquímicas que se detallan en la Tabla 1 y se diferencia fenotípicamente de otras especies de Pseudomonas por las pruebas que se muestran en la Tabla 2.

La temperatura de crecimiento está comprendida entre 5 ºC y 30 ˚C, con un óptimo entre 25 ºC y 30 ºC. No crece ni a 33 ºC ni a 0 ºC.

El crecimiento en placas puede llevarse a cabo en medio de cultivo AN (Agar Nutritivo: Triptona 5 g/l, extracto de carne 3 g/l, agar 15 g/l) , TSA (Caldo de triptona soja: triptona 15 g/l, peptona de soja 5, 0 g/l, cloruro sódico 5, 0 g/l y agar 15 g/l, pH 7, 3) o NYDA (Caldo nutritivo: 8 g/l; extracto de levadura, 5 g/l; dextrosa, 10 g/l y agar 15 g/l) .

El crecimiento en líquido puede llevarse a cabo en medio de cultivo TSB (Caldo de triptona soja: digerido pancreático de caseína 17, 0 g/l, digerido enzimático de soja 3, 0 g/l, cloruro sódico 5, 0 g/l, dipotasio hidrógeno fosfato 2, 5 g/l, glucosa 2, 5 g/l, pH 7, 3) . También puede usarse el medio NB (Caldo nutritivo: triptona 10 g/l, extracto de carne 5 g/l, cloruro sódico 5 g/l, pH 7, 2)

El crecimiento de la cepa CBS124167 en medio TSB o NB en condiciones aerobias, en agitación y a temperatura de 25 y 30 ºC, alcanza un máximo poblacional a las 20-24 h de incubación (generalmente entre 1, 9 y 2, 9 × 109 unidades formadoras de colonias (ufc) /ml) , sin presentar grandes diferencias entre los dos medios de cultivo.

Tabla 1. Pruebas enzimáticas...

1. Cultivo biológico sustancialmente puro de una cepa de la especie Pseudomonas graminis, depositada con el número CBS124167 en la institución de depósito “Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) de Utrech, Holanda.

2. Uso del cultivo CBS124167 de la reivindicación 1 como antagonista para el control biológico de bacterias patógenas de transmisión alimentaria en fruta para consumo humano.

3. Usos según la reivindicación 2, en la que dicha fruta es fruta cortada a trozos o fruta de cuarta gama.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que dichas bacterias patógenas son microorganismos Salmonella spp.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dichas bacterias patógenas son microorganismos Listeria spp.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que dichas bacterias patógenas son microorganismos Escherichia coli O157:H7.

7. Uso según la reivindicación 4, en el que la Salmonella spp. es de la especie Salmonella choleraesuis.

8. Uso según la reivindicación 5, en el que la Listeria spp. es de cualquiera de las especies Listeria monocytogenes o Listeria innocua.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que dicho control biológico se lleva a cabo manteniendo la fruta a una temperatura superior a 10 ºC.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que dicho control biológico se lleva a cabo manteniendo la fruta a una temperatura igual o superior a 20 ºC.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que dicho control biológico se lleva a cabo manteniendo la fruta en condiciones de refrigeración.

12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en el que dicho control biológico se lleva a cabo manteniendo la fruta en una atmósfera modificada.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que dicha fruta es fruta con un pH comprendido entre 3 y 7.

14. Uso según la reivindicación 13, en el que dicha fruta es manzana.

15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en el que dicha fruta es melocotón.

16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicha fruta es melón.

17. Método para tratar fruta que comprende la etapa de aplicar a la fruta una preparación que comprende un cultivo de una cepa de la especie Pseudomonas graminis, depositada con el número CBS124167 en la institución de depósito “Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) de Utrech, Holanda.

18. Método según la reivindicación 17, que comprende la etapa de cortar la fruta a trozos antes de aplicar dicha preparación.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 18, en el que la concentración de la cepa CBS124167 en dicha preparación es igual o superior a la concentración estimada de patógeno que puede contener la fruta.

20. Método según la reivindicación 19, en el que la concentración de la cepa CBS124167 en dicha preparación es igual o superior a 105 ufc/ml.

21. Método según la reivindicación 20, en el que la concentración de la cepa CBS124167 en dicha preparación es igual o superior a 107 ufc/ml.

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, que comprende la etapa de envasar dicha fruta una vez aplicada dicha preparación.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, que comprende la etapa de proporcionar a dicha fruta una atmósfera modificada.

24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, que comprende la etapa de proporcionar a dicha fruta una temperatura de refrigeración.

25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, que comprende la etapa de aplicar un antioxidante a la fruta, antes de aplicar dicha preparación.

3, 0 2, 0 1, 0 0, 0

8, 0

Escherichia coli O157:H7, log10 ufc/g manzana Salmonella, log10 ufc/g manzana 6, 0 5, 0 4, 0

7, 0 6, 0 5, 0 4, 0 3, 0 2, 0 1, 0 0, 0

CPA-1

oncentración inicial

Concentracióninicial

Control

Control

(0.3)

(0.6)

(0.6)

(0.8) (0.7) (0.8)

(0.9)

CPA-1

CPA-2

CPA-2

PN5

PN5

PN6CPA-5

PN6

CPA-5

M174BAL2

M174BAL2

EL8

EL8

128-M

128-M

C9 P21

8, 0 7, 0 (1.2) (1.0) (1.1)

(1.3)

(1.3) (1.2)

(1.4) (1.2)

C9 P21

CBS-124167

(4.5)

CBS-124167

CPA-5

EL8 RG4

CPA-1

CPA-2

PN5

CPA-2

PN6

PN6

CPA-5

CPA-3

M174BAL2

F-10

CBS-124167

EL8

C9 P21128-M

128-M

C9 P21CBS-124167

Listeria innocua, log10 ufc/g melocotón 9, 0 8, 0 7, 0 6, 0 5, 0 4, 0 3, 0 2, 0 1, 0 0, 0

Concenttración inicial

Control

Concentracióninicial

Control

CPA-5

EL8

RG4

CPA-2PN6

CPA-3

F-10

CBS-124167

C9 P21

128-M

(0.7)

(0.7) (0.9)

(1.0)

(1.9) (1.9)

(2.1)

(2.1)

(2.1)

(4.0)

CPA-5

EL8

RG4

CPA-2

PN6

CPA-3

F-10

CBS-124167

C9 P21

128-M

M247 PSI1

Concentración inicial

Concentracióninicial

Control

Control

M247 PSI1

M290 PSI4

PAJ

M290 PSI4

M308 PSI5

M201 PSI3128-G

F-10

CBS-124167

M172 PSI1

C-9 P-21

128-MM309 PSI7

M201 PSI 3

128-G

F-10

CBS-124167

M172 PSI1

C-9 P-21

128-M

Días de conservación 5, 0

4, 0

3, 0

2, 0

Control_5ºC CBS-124167_5ºC

Escherichia coli O157:H7, log10 ufc/g melocotón

Días de conservación 0 2 4 6 810

Días de conservación Listeria monocytogenes , log10 ufc / g melón

8, 0 9, 0 10, 0 11, 0 Control_10ºC CBS-124167_10exp6 ufc/ml_10ºC CBS-124167_ 10exp7 ufc/ml_10ºC CBS-124167_10exp8 ufc/ml_10ºC

7, 0

6, 0

5, 0

4, 0

3, 0

2, 0 0 2 4 6 Días de conservación 8 10

Días de conservación Salmonella, log10 ufc/g manzana)

Listeria monocytogenes, log10 ufc/g

8, 0

7, 0

5, 0 6, 0

4, 0

0, 0 1, 0 2, 0 3, 0 0 3 6 9 Días en conservación 12 Control_10 ºC CBS-124167_10ºC Control_ 5 ºC CBS-124167_5ºC 15

9, 0 8, 0 7, 0 6, 0

manzana

5, 0

0, 0 1, 0 2, 0 3, 0 4, 0 0 3 6 9 Días de conservación 12 Control_10ºC CBS-124167_10ºC Control_5 ºC CBS-124167_5ºC 15