Constructos sin soporte para ingeniería de tejido de cartílago articular.

Un proceso para producir un constructo de cartílago articular producido mediante ingeniería de tejido comprendiendo:

a) recubrir al menos una superficie de un recipiente de cultivo de tejido con un material de recubrimiento que no es conductivo para unión celular;

b) introducir sobre dicha al menos una superficie recubierta de material una suspensión de condrocitos vivos en medio de cultivo, en donde la suspensión comprende 1 x 106 o más condrocitos vivos por cm2 de la al menos una superficie cubierta por material;

c) permitir a los condrocitos sedimentarse en dicho recubrimiento para formar un agregado celular inicial a través de un proceso de auto ensamblaje; y

d) cultivar dicho agregado inicial para dar un constructo de cartílago sin soportes, o un intermedio del mismo.

La presente solicitud se refiere a la ingenieria de tejidos. La ingenieria de tejidos es un área de intenso esfuerzo hoy en el campo de las ciencias biomedicas. Se ha demostrado que la unión, extensión y replicación celular in Vitro ocurren en varios sustratos, y la formación de masas de tejido sólido ha sido demostrada para tejidos tales como cartílago. La mayoría de los métodos para preparar constructos cartilaginosos se dirige hacia el uso de varios soportes como portadores celulares. Normalmente, los condrocitos sembrados migran del soporte al fondo del recipiente o pocillo para cultivo de tejido, incluso si las placas no son tratadas para promover la adhesión celular. Normalmente, las células en placas no tratadas para tejido aún se unirán eventualmente. Dentro de una semana de cultivo, las proteinas hechas por los condrocitos o suministradas en el medio normalmente se han adsorbido por el fondo de los pocillos para promover la unión. Los resultados son una reducción en el tamaño del constructo. Otro inconveniente es que las células unidas tienden a aplanarse y cambiar a un diferente fenotipo. Esas células compiten con los condrocitos restantes por los nutrientes y no producen las proteinas deseadas de matriz extracelular para la regeneración del cartílago.

Ciertas técnicas de cultivo han sido investigadas para producir cartílago, incluyendo cultivo pellet1, 2, 3 y cultivo agregado. 3 En "cultivo pellet, " condrocitos aislados fueron primero centrifugados en pellets. Tras un par de días de cultivo en los tubos de centrifugado (para permitir agregarse a la masa de las células) , estos pellets fueron entonces transferidos sobre varias superficies, incluyendo hidrogeles, o dejados en los tubos centrifugos para cultivo. En “cultivo agregado”, una baja densidad de células por superficie de área fue mantenida en placas con seis pocillos cubiertos con hidrogel con o sin turbulencia suave. Una suspensión celular cultivada en estas placas cubiertas con hidrogel forma agregados dentro de las primeras 72 h de cultivo.3 Los agregados resultantes fueron entonces cultivados en pocillos cubiertos con hidrogel. Otras técnicas de cultivo implicando agarosa incluyen la encapsulación celular, 4 en la cual los condrocitos son mezclados dentro de agarosa fundida para resultar en un constructo que contiene agarosa por todos lados. Permanece una necesidad de un forma adecuada de producir constructos de tejido de cartílago que mantenga la apariencia y las características de los condrocitos normales.

Cultivos de condrocitos de pollo son revelados por: TACCHETTI C ET AL: "In vitro morphogenesis of chick embr y o hypertrophic cartilage."THE JOURNAL OF CELL BIOLOGY, vol. 105, no. 2. 1 August 1987 (1987-08-01) , pages 999-1006, ISSN: 0021-9525; y TURNEY J ET AL: "Changes in the expression of annexin A5 gene during in vitro chondrocyte differentiation: influence of cell adjuntarment." JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY, vol. 84, no. 1, 2002, pages 132-142, ISSN: 0730-2312.

Condrocitos humanos son revelados por: SABBATINI A ET AL: "Use of human chondrocyte cell cultures to identify and characterize reactive antibodies in arthritis sera." CLINICAL AND EXPERIMENTAL RHEUMATOLOGY, vol. 21, no. 5, September 2003 (2003-09) , pages 587-592, ISSN: 0392-856X.

La presente incención busca superar algunos de los inconvenientes inherentes en el estado de la técnica proporcionando métodos para usar en el cultivo de condrocitos para formar constructos que contengan porcentajes mayores de células que retienen el fenotipo condrocítico. Otro aspecto de la presente invención se refiere a los constructos producidos mediante tejido útiles para formar neocartilago conteniendo composiciones para una variedad de fines in vivo e in vitro. Otro aspecto más de la invención se refiere a métodos pata tratar individuos con necesidad de crecimiento de cartilago articular. Estos y otros objetos pueden ser logrados por el proceso como se define en las reivindicaciones independientes. Mejoras adicionales son definidas en las reivindicaciones dependientes.

De acuerdo con ciertas realizaciones de la presente invención, se proporciona un proceso para producir un constructo de cartílago articular producido por ingeniería de tejido el cual comprende: a) cubrir al menos una superficie de un recipiente de cultivo de tejido con un material adecuado que no es conduce a la unión celular (por ejemplo, un hidrogel) ; b) introducir sobre cada superficie cubierta con material una suspensión de condrocitos vivos en un medio de cultivo donde la suspensión comprende casi 1 x 106 o más condrocitos vivos por cm2 de la al menos una superficie cubierta con material; c) permitir que los condrocitos se sedimenten sobre el material de revestimiento para formar un agregado celular. Este proceso de agregación celular para resultar en un constructo, o un intermedio del mismo, es denominado el “Proceso de Auto Ensamblaje." El proceso ademas incluye d) cultivar el agregado para dar el constructo del cartílago, o intermedio del mismo. Para facilidad de referencia, los pasos del proceso son denotados como pasos a, b, c, etc. Un orden fijo de realización de los pasos no está necesariamente afectado por el orden en el cual los pasos son listados, sin embargo. En algunas realizaciones, el paso a) incluye cubrir una o más superficies del recipiente de cultivo con el hidrogel. Alternativamente, el recipiente de cultivo (por ejemplo, una pluralidad de pocillos) es extraida de un molde de hidrogel, o se usa un hidrogel para formar uno o más pocillos o recipientes con cultivo celular. En algunas realizaciones, el paso d) da el intermedio, y el proceso tambien incluye e) sembrar el intermedio con los condrocitos vivos adicionales; y f) cultivar el intermedio sembrado para aumentar el grosor del constructo o intermedio del mismo en realizaciones preferidas, paso b) de un proceso arriba descrito incluye sembrar cada superficie cubierta con hidrogel con una suspensión conteniendo al menos 25 x 106 condrocitos vivos por cm2 de superficie cubierta con hidrogel. En ciertas realizaciones, un proceso arriba descrito comprende seleccionar un hidrogel comprendiendo agarosa, alginato o polyHEMA. En algunas realizaciones ello comprende 0.5 - 4 % (p/v) agarosa, preferiblemente 2%.

Tambien se proporciona de acuerdo con ciertas realizaciones de la presente revelación una composición comprendiendo al menos un constructo producido por ingeniería de tejido sin soportes preparado por un proceso como se describe arriba, y comprendiendo una multiplicidad de condrocitos vivos difernciados redondeados. En algunas realizaciones, el constructo comprende una periferia que es sustancialmente carecedora de condrocitos no fenotipicos. En realizaciones preferidas el constructo comprende condrocitos capaces de producir colágeno de tipo II. Algunas realizaciones proporcionan una composición en donde el constructo comprende un módulo de compresión de al menos un cuarto del tamaño del cartílago de codo bovino nativo. En algunas realizaciones, el módulo de compresión del constructo es al menos un tercio del cartílago de codo bovino nativo. Otra composición proporcionada por la presente revelación comprende un tapón bifasico incluyendo un componente óseo y un constructo de cartílago producido mediante ingeniería tejido antes descrito.

Se revela un método para tratar a un individuo con necesidad de sustitución de cartilago articular. Este método comprende implantar en un sitio en el individuo donde el cartílago articular es deseado una composición que comprende al menos un constructo producido mediante ingeniería de tejido conteniendo una multiplicidad de condrocitos vivos redondeados diferenciados preparados por un proceso como se describe arriba.

La presente revelación también proporciona un método para tratar a un individuo con necesidad de sustitución de cartilago articular comprendiendo implantar en un sitio en el individuo donde el cartilago articular se desee una composición comprendiendo al menos un constructo producido mediante ingeniería de tejido comprendiendo una composición como se describe arriba.

Estas y otras realizaciones, características y ventajas de la presente invención se harán patentes con referencia, a modo de ejemplo, a la siguiente descripción y dibujos.

Fig. 1 es una fotomicrografia mostrando una vista superior de discos de un constructo de cartílago con forma de bol de 12 mm preparado de acuerdo a una realización de la presente invención;

Fig. 2 es una fotomicrografia mostrando una vista lateral de los discos en la Fig. 1. Cada marca representa 1 mm;

Fig. 3 es una fotomicrografia de secciones de 14 ttm de discos teñidos con safranina-O/verde rápido, similar a los mostrados en la Fig. 1;

Fig. 4 es... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para producir un constructo de cartílago articular producido mediante ingeniería de tejido comprendiendo:

a) recubrir al menos una superficie de un recipiente de cultivo de tejido con un material de recubrimiento que no es conductivo para unión celular;

b) introducir sobre dicha al menos una superficie recubierta de material una suspensión de condrocitos vivos en medio de cultivo, en donde la suspensión comprende 1 x 106 o más condrocitos vivos por cm2 de la al menos una superficie cubierta por material;

c) permitir a los condrocitos sedimentarse en dicho recubrimiento para formar un agregado celular inicial a través de un proceso de auto ensamblaje; y

d) cultivar dicho agregado inicial para dar un constructo de cartílago sin soportes, o un intermedio del mismo.

2. Un proceso para producir un constructo de cartílago articular producido mediante ingeniería de tejido comprendiendo:

a) formar una pluralidad de pocillos de cultivo de tejido de un material polimerico que no es conductivo para la unión celular;

b) introducir sobre dichos pocillos una suspensión de condrocitos vivos en medio de cultivo, en donde la suspensión comprende 1 x 106 o más condrocitos vivos por cm2 de la superficie del pocillo;

c) permitir a los condrocitos sedimentarse en dichos pocillos para formar un agregado celular inicial a través de un proceso de auto ensamblaje; y

d) cultivar dicho agregado inicial para dar un constructo de cartílago sin soportes, o un intermedio del mismo.

3. El proceso de la Reivindicación 1 o 2, en donde el paso d) da dicho intermedio, y dicho proceso comprende e) sembrando dicho intermedio con condrocitos vivos adicionales; y f) cultivar dicho intermedio sembrado para aumentar el grosor de dicho constructo o intermedio del mismo.

4. El proceso de acuerdo a una de las Reivindicacións precedentes, en donde el paso b) comprende sembrar cada dicha superficie cubierta por material con una suspensión comprendiendo al menos 25 x 106 o más condrocitos vivos por cm2 de área cubierta por material.

5. El proceso de acuerdo a una de las Reivindicacións precedentes, donde dicho material comprende un hidrogel.

6. El proceso de la Reivindicación 5 en donde dicho hidrogel es elegido del grupo formado por agarosa, alginato y polyHEMA.

7. El proceso de la Reivindicación 6 en donde dicho hidrogel comprende 0.5 - 4 % (p/v) de agarosa.

8. El proceso de la Reivindicación 7 en donde dicho hidrogel comprende 2% (p/v) de agarosa

9. El método de cualquiera de las Reivindicaciónes 1 a la 8 además comprendiendo el paso de formar un tapón bifásico comprendiendo un componente oseo y el constructo de cartílago sin soportes.

10. El método de cualquiera de las Reivindicacións 1 a la 8 ademas comprendiendo el paso de usar el constructo de cartílago sin soportes en formar un dispositivo protésico para la reparación o sustitución del cartílago dañado.

11. El método de cualquiera de las Reivindicaciónes 1 a la 8 además comprendiendo el paso de perforar los tapones del constructo de cartílago sin soportes.

FIG. 2