Composiciones y procedimientos de producción de metionina.

Una E. coli aislada para producir metionina, comprendiendo la E.

coli aislada:

uno o más primeros péptidos que comprenden la actividad de sulfhidrilación directa de homocisteína-sintasa, en elque los péptidos usan O-acetil-L-homoserina (OAHS) u O-succinil-L-homoserina (OSHS) como sustrato;

uno o más segundos péptidos que comprenden la actividad de transulfuración de cistationina-γ-sintasa y cistationina-ß-liasa; y

un péptido de homoserina-O-succiniltransferasa que comprende las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10,

en el que la actividad de sulfhidrilación directa procede de la expresión de una secuencia de ácidos nucleicosexógena que codifica homocisteína-sintasa.

Composiciones y procedimientos de producción de metionina.

CAMPO

Se desvelan composiciones, como microorganismos, enzimas y productos químicos, así como procedimientos para usar los mismos para producir metionina y productos relacionados.

ANTECEDENTES

La metionina es un aminoácido esencial en la dieta animal. La metionina se ha producido sintéticamente durante un amplio periodo de tiempo mediante varias síntesis químicas de etapas múltiples que emplean acroleína, metil-mercaptano y cianuro como materiales de partida. Existen dos formas del producto: D, Lmetionina y su análogo hidróxido. La D-metionina se convierte en el isómero L requerido in vivo, a diferencia de todos los demás aminoácidos. Se ha comunicado que el mercado de metionina con calidad para pienso está mejorando debido a una creciente demanda en los suplementos para aves de corral y más recientemente para el ganado porcino. La capacidad de los principales productores de metionina (Degussa AG, Adisseo y Novus) de cumplir con las demandas del mercado gira en torno a los suministros de materias primas. Los productos intermedios acroleína y metil-mercaptano deben ser convertidos en 3-metiltiopropionaldehído (MMP) y posteriormente en metionina usando hidrogenocianuro. Los tres productores tienen planes para ampliar sus instalaciones de producción de metionina y también de integración con producción de materias primas (Chem. Marketing Reporter, 7 de abril de 2003) .

Las vías biosintéticas para la metionina (un miembro de la familia de aminoácidos de aspartato) han sido objeto de estudio en diversos organismos y muestran tanto semejanzas como diferencias. La primera etapa dedicada, la acilación de homoserina es catalizada por la homoserina-aciltransferasa, y es ubicua en todos los organismos a pesar de las diferencias en el grupo acilo transferido. El producto de la catálisis de metA es acetilhomoserina o succinilhomoserina. La acilhomoserina se convierte a continuación en homocisteína por medio de una vía de transulfuración o una sulfhidrilación directa. Se ha comunicado que las dos vías están presentes y funcionales en levaduras, hongos, plantas verdes y en la bacteria Cor y nebacterium glutamicum. E. coli posee sólo la vía de la transulfuración. La vía de la transulfuración pasa por la cistationina como producto intermedio y usa cisteína como donador de azufre. La vía de sulfhidrilación directa supone la incorporación directa de sulfuro a la acilhomoserina. La última etapa de la vía supone la conversión de homocisteína en metionina catalizada por una homocisteína-metiltransferasa, codificada por los genes metE o metH.

Otros aminoácidos importantes, como lisina, treonina y triptófano, son producidos por medio de fermentación para su uso en pienso animal. Por tanto, estos aminoácidos pueden prepararse usando glucosa y otros recursos renovables como materiales de partida. Por desgracia, la producción de metionina por medio de fermentación no ha resultado tan provechosa y hoy en día sigue usándose la síntesis química de metionina. Esto se debe en parte a la falta de una vía biosintética eficaz diseñada por ingeniería para la producción de metionina, y un hospedador para la producción adecuado.

El documento WO-2007/011.939 se refiere al uso de disulfuro de dimetilo para producción de metionina en microorganismos.

La siguiente descripción proporciona una vía biosintética de la metionina mejorada, así como un hospedador para la producción.

RESUMEN

El objeto para el cual se pretende obtener protección es el que se define en las reivindicaciones. En particular, la presente invención proporciona una E. coli aislada para producir metionina, comprendiendo la E. coli aislada:

uno o más primeros péptidos que comprenden la actividad de sulfhidrilación directa de homocisteína-sintasa, en el que los péptidos usan O-acetil-L-homoserina (OAHS) u O-succinil-L-homoserina (OSHS) como sustrato;

uno o más segundos péptidos que comprenden la actividad de transulfuración de cistationina-y-sintasa y cistationina1-liasa; y

un péptido de homoserina-O-succiniltransferasa que comprende las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10, en el que la actividad de sulfhidrilación directa procede de la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos exógena que codifica homocisteína-sintasa.

La invención proporciona además un procedimiento para preparar metionina que comprende:

cultivo de la E. coli aislada de la invención en condiciones que permiten la producción de metionina; y aislamiento de la metionina.

La producción de metionina y los productos relacionados, como S-adenosilmetionina (SAMe) , por fermentación se describen en la presente memoria descriptiva. También se describen los microorganismos que han sido diseñados por ingeniería genética para incluir moléculas de ADN recombinantes y producir metionina.

Se describe un microorganismo que incluye una secuencia de ácidos nucleicos exógena que codifica un péptido que tiene actividad de sulfhidrilación directa (EC 2.5.1.49, EC 4.2.99-) , y secuencias de ácidos nucleicos endógenas que codifican péptidos que tienen actividad de transulfuración (EC 2.5.1.48 y 4.4.1.8) . Este microorganismo puede producir metionina y productos relacionados. En algunos ejemplos, el microorganismo puede tener al menos 0, 1, 1, 2, 5, 10, 50, 75, 90, o al menos 100 g/l de concentración extracelular de metionina o SAMe.

En algunos ejemplos, la presencia de más de una vía biosintética de la metionina permite al organismo producir más metionina de la que sería producida en ausencia de la secuencia de ácidos nucleicos exógena que codifica el péptido que tiene actividad de sulfhidrilación directa.

En otros ejemplos, pueden estar activas más de dos vías biosintéticas de metionina en el organismo. En estos ejemplos una o más secuencias de ácidos nucleicos exógenas codifican para péptidos que tienen actividad de sulfhidrilación directa. Uno de estos péptidos puede usar O-succinilhomoserina como sustrato y otro péptido puede usar O-acetilhomoserina como sustrato.

En algunos ejemplos, los microorganismos diseñados por ingeniería para preparar metionina y productos relacionados, como SAMe, producen al menos el 10% de la metionina a partir de la actividad de la vía biosintética de transulfuración. En otros ejemplos producen al menos el 20, el 30, el 40 o al menos el 50% del producto a partir de la actividad de la vía biosintética de transulfuración.

En algunos ejemplos, los microorganismos diseñados por ingeniería para preparar metionina y productos relacionados, como SAMe, producen al menos el 10% de la metionina de la actividad de la vía biosintética de sulfhidrilación directa. En otros ejemplos producen al menos el 20, el 30, el 40 o al menos el 50% del producto a partir de la actividad de la vía biosintética de sulfhidrilación directa.

En algunos ejemplos, el microorganismo diseñado por ingeniería para preparar metionina y productos relacionados ha sido diseñado adicionalmente por ingeniería para atenuar la actividad de un péptido codificado por un gen como metD, metK, metJ, thrB, serA o combinaciones de los mismos. En otros ejemplos, el microorganismo está diseñado adicionalmente por ingeniería para expresar en exceso uno o más genes, como los genes metA, metB, metC, metE, metY, metZ, metX, metH, cysPWUA, cysD, cysN, cysC, cysH, cysI, cysJ, cysG, csyK y cysM.

También se proporcionan procedimientos para preparar metionina y SAMe. Estos procedimientos incluyen el cultivo del microorganismo diseñado por ingeniería para preparar metionina y productos relacionados y el aislamiento de los productos. En algunos ejemplos el microorganismo puede ser E. coli, Pseudomonas sp. o Cor y nebacterium glutamicum.

También se describen en la presente memoria descriptiva nuevas secuencias de ácidos nucleicos y sus secuencias de aminoácidos correspondientes (SEQ ID NO: 1 y 2) . Estas secuencias de ácidos nucleicos, así como los fragmentos y variantes de estas secuencias de ácidos nucleicos, son útiles para producir péptidos en microorganismos recombinantes. Los péptidos son útiles, entre otros, para producir metionina y SAMe. Los péptidos, las variantes de los mismos y los fragmentos de los mismos, son también útiles para producir agentes de unión específicos como, por ejemplo, anticuerpos.

Se desvela también un procedimiento para mejorar la asimilación de azufre mediante el puenteo del producto intermedio fosfoadenililsulfato (PAPS) . Este procedimiento puede usarse con cualquier microorganismo usado para producir metionina. El procedimiento se consigue introduciendo en un microorganismo una secuencia de ácidos... [Seguir leyendo]

1. Una E. coli aislada para producir metionina, comprendiendo la E. coli aislada:

uno o más primeros péptidos que comprenden la actividad de sulfhidrilación directa de homocisteína-sintasa, en el que los péptidos usan O-acetil-L-homoserina (OAHS) u O-succinil-L-homoserina (OSHS) como sustrato; uno o más segundos péptidos que comprenden la actividad de transulfuración de cistationina-y-sintasa y cistationina

1. liasa; y un péptido de homoserina-O-succiniltransferasa que comprende las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10, en el que la actividad de sulfhidrilación directa procede de la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos exógena que codifica homocisteína-sintasa.

2. La E. coli aislada de la reivindicación 1, en la que al menos el 10% de la metionina producida procede de la actividad de transulfuración.

3. La E. coli aislada de la reivindicación 1, en la que al menos el 10% de la metionina producida procede de la actividad de sulfhidrilación directa.

4. La E. coli aislada de la reivindicación 1, que comprende además una secuencia de ácidos nucleicos exógena que codifica una adenilil-sulfato-reductasa.

5. La E. coli aislada de la reivindicación 1, en la que al menos un gen seleccionado entre metD, metK, metJ, thrB, serA o combinaciones de los mismos está atenuado.

6. La E. coli aislada de la reivindicación 1, en la que al menos un gen seleccionado entre metA, metB, metC, metE, metY, metZ, metX, metH, cysPWUA, cysD, cysN, cysC, cysH, cysI, cysJ, cysG, csyK, cysM, y combinaciones de los mismos, está expresado en exceso.

7. Un procedimiento de preparación de metionina que comprende: cultivo de la E. coli aislada de la reivindicación 1 en condiciones que permiten la producción de metionina; y aislamiento de la metionina.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la E. coli aislada comprende un primer péptido que tiene actividad de homocisteína-sintasa para sulfhidrilación directa, en el que el primer péptido está codificado por metZ, metY o combinaciones de los mismos.

9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la E. coli aislada comprende un segundo péptido que tiene actividad de cistationina-y-sintasa y actividad de cistationina-1-liasa para transulfuración, en el que el segundo péptido está codificado por metB y metC.

10. La E. coli aislada de la reivindicación 1, que comprende además un péptido de homoserina-Oacetiltransferasa.

11. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el primer péptido es un péptido de homocisteínasintasa codificado por metY.

12. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el primer péptido es un péptido de homocisteínasintasa codificado por metZ.

13. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el microorganismo comprende además al menos uno entre un gen atenuado seleccionado entre metD, metK, metJ, thrB, serA o combinaciones de los mismos.

14. La E. coli aislada de la reivindicación 1, que comprende además una cistationina-gamma-sintasa expresada a partir de una secuencia de ácidos nucleicos endógena y una homocisteína-sintasa expresada a partir de una secuencia de ácidos nucleicos exógena.

15. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la E. coli aislada comprende además una molécula

de ADN recombinante que expresa en exceso adenilil-sulfato-reductasa.