Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina.

Una composición inmunogénica que comprende un antígeno derivado de citomegalovirus (CMV) en combinacióncon un adyuvante,

en la que el adyuvante comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa derivadade la corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la quedicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en la composición a un nivel de entre 1 1μg y 30 μg por dosis para su uso como medicamento humano.

Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina Campo de la técnica La presente invención se refiere a composiciones de vacunas mejoradas, a procedimientos para fabricarlas, y a su uso en medicina. En particular, la invención se refiere a composiciones de vacunas potenciadas con adyuvante en las que el adyuvante es una formulación liposómica, que comprende una saponina y un lipopolisacárido.

Antecedentes de la técnica Siempre se necesitan composiciones o vacunas nuevas con una inmunogenicidad mejorada. Como estrategia, se han usado adyuvantes para probar y mejorar la respuesta inmunitaria provocada por cualquier antígeno dado.

Los lipopolisacáridos (LPS) son las moléculas superficiales principales de, y se encuentran exclusivamente en, la lámina externa de la membrana exterior de bacterias gram-negativas. Los LPS impiden la destrucción de la bacteria por complementos del suero y células fagocíticas, y están implicados en la adherencia para la colonización. Los LPS son un grupo de moléculas complejas estructuralmente relacionadas de aproximadamente 10.000 Dalton de tamaño y consisten en tres regiones unidas de forma covalente:

(i) una cadena de polisacárido O-específica (antígeno O) en la región externa

(ii) una región central de oligosacárido del núcleo

(iii) lípido A -la región más interna que sirve como anclaje hidrófobo, comprende unidades de disacárido de glucosamina que llevan ácidos grasos de cadena larga.

Se ha mostrado que las actividades biológicas de LPS, tales como toxicidad letal, pirogenicidad y adyuvancia, están relacionadas con el resto de lípido A. Por el contrario, la inmunogenicidad está asociada con el componente de polisacárido O-específico (antígeno O) . Tanto los LPS como el lípido A se conocen desde hace tiempo por sus efectos adyuvantes fuertes, pero la alta toxicidad de estas moléculas ha impedido su uso en formulaciones de vacunas. Se ha hecho por lo tanto un esfuerzo significativo para reducir la toxicidad de los LPS o lípido A manteniendo al mismo tiempo su adyuvancia.

El mutante R595 de Salmonella minnesota se aisló en 1996 a partir de un cultivo de la cepa parental (lisa) (Luderitz y col. 1966 Ann. N. Y. Acad. Sci. 133:349-374) . En las colonias seleccionadas se exploró su susceptibilidad a lisis con un grupo de fagos, y sólo las colonias que presentaron un intervalo de sensibilidad estrecho (susceptibles a uno o dos fagos solamente) se seleccionaron para estudio adicional. Este esfuerzo condujo al aislamiento de una cepa mutante rugosa profunda que es defectuosa en la biosíntesis de LPS y se denomina S. minnesota R595.

En comparación con otros LPS, los producidos por el mutante S. minnesota R595 tienen una estructura relativamente sencilla.

(i) no contienen región O-específica -una característica que es responsable de la deriva del fenotipo liso de tipo salvaje al fenotipo rugoso mutante y produce una pérdida de virulencia

(ii) la región del núcleo es muy corta -esta característica aumenta la susceptibilidad de la cepa a una diversidad de productos químicos

(iii) el resto de lípido A está altamente acilado con hasta 7 ácidos grasos.

El 4’-monofosforil lípido A (MPL) , que puede obtenerse por la hidrólisis ácida de LPS extraído de una cepa mutante rugosa profunda de bacterias gram-negativas, mantiene las propiedades adyuvantes de los LPS demostrando una toxicidad que está reducida en un factor de más de 100 (como se mide por dosis letal en huevos embrionarios de pollo) (Johnson y col. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Supl.: S512-S516) . Los LPS se calientan a relujo típicamente en soluciones de ácido mineral para moderar su fuerza (por ejemplo, HCl 0, 1 M) durante un periodo de aproximadamente 30 minutos. Este procedimiento produce desfosforilación en la posición 1, y descarbohidratación en la posición 6’, produciendo MPL.

El monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL) , que puede obtenerse por hidrólisis alcalina leve de MPL, tiene una toxicidad reducida adicionalmente manteniendo de nuevo la adyuvancia, véase el documento US 4.912.094 (Ribi Immunochemicals) . La hidrólisis alcalina se realiza típicamente en disolvente orgánico, tal como una mezcla de cloroformo/metanol, por saturación con una solución acuosa de una base débil, tal como carbonato sódico 0, 5 M a pH 10, 5.

Se dispone de información adicional sobre la preparación de 3D-MPL en, por ejemplo, los documentos US 4.912.094 y WO02/078637 (Corixa Corporation) .

Las saponinas de Quillaja son una mezcla de glicósidos de triterpeno extraídos de la corteza del árbol Quillaja saponaria. Se han empleado de forma extensa saponinas brutas como adyuvantes veterinarios. Quil-A es un extracto acuoso parcialmente purificado del material de saponina de Quillaja. QS21 es una fracción no tóxica purificada por HPLC de Quil A y su procedimiento de producción se describe (como QA21) en la Patente de Estados Unidos Nº 5.057.540.

A modo de ejemplo se han desarrollado vacunas contra la gripe y vacunas contra el virus de papiloma humano (VPH) con adyuvantes.

El documento WO 96 33 739 divulga una composición de vacuna que comprende una saponina inmunológicamente activa y un esTerol.

Todavía hay la necesidad de vacunas mejoradas.

Los adyuvantes que contienen lipopolisacáridos y saponinas de Quillaja se han descrito anteriormente, por ejemplo en el documento EP0671948. Esta patente demostró una fuerte sinergia cuando se combinaba un lipopolisacárido (3D-MPL) con una saponina de Quillaja (QS21) . Ahora se ha descubierto que pueden conseguirse buenas propiedades adyuvantes con combinaciones de lipopolisacárido y saponina de quillaja como inmunoestimulantes en una composición adyuvante incluso cuando los inmunoestimulantes están presentes en bajas cantidades en una dosis humana.

Declaración de la invención En la presente invención se proporciona la reivindicación 1.

Adecuadamente, el adyuvante de saponina en forma de un liposoma de acuerdo con la invención comprende una fracción activa de la saponina obtenida de la corteza de Quillaja Saponaria Molina, tal como QS21, y un esterol, tal como colesterol, en una proporción saponina:esterol de 1:1 a 1:100 p/p.

En particular, dicha composición inmunogénica comprende un antígeno con un epítopo de célula T CD4. Como alternativa, dicha composición inmunogénica comprende un antígeno con un epítopo de célula B.

La divulgación también se refiere al uso de un antígeno o antígenos de citomegalovirus o preparación antigénica del mismo, y un adyuvante que comprende una fracción saponina inmunológicamente activa obtenida de la corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido en la preparación de una composición inmunogénica para la prevención de infección y/o enfermedad por citomegalovirus.

La divulgación también describe el uso de (a) un antígeno o preparación antigénica del mismo, y (b) un adyuvante como se ha definido anteriormente en el presente documento en la fabricación de una composición inmunogénica para inducir, en un ser humano, al menos una, o al menos dos, o todas de las siguientes: (i) una respuesta inmunitaria de células T CD4 mejorada contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo, (ii) una respuesta inmunitaria humoral mejorada contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo, (iii) una respuesta de células B de memoria mejorada contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo.

En particular dicho antígeno es un antígeno citomegalovirus (CMV) , o preparación antigénica del mismo, y dicho ser humano es un individuo o población inmunocomprometida, tal como un adulto de alto riesgo, un adulto anciano o un niño. En una realización específica, se proporciona el uso de un antígeno o preparación antigénica del mismo y un adyuvante como se define en el presente documento en la preparación de una composición inmunogénica para la vacunación de un ser humano, en particular un ser humano adulto anciano, contra el patógeno del que se obtiene el antígeno en la composición inmunogénica. Específicamente dicho antígeno es un antígeno o antígenos de citomegalovirus o preparación antigénica de los mismos.

La divulgación también describe un procedimiento de vacunación que comprende el suministro de un antígeno o composición antigénica, en particular citomegalovirus, o preparación antigénica de los mismos y un adyuvante como se ha definido anteriormente en el presente documento a un individuo o población en necesidad del mismo.

La divulgación también describe que la composición inmunogénica es capaz de inducir una... [Seguir leyendo]

1. Una composición inmunogénica que comprende un antígeno derivado de citomegalovirus (CMV) en combinación con un adyuvante, en la que el adyuvante comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la que dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en la composición a un nivel de entre 1 1 μg y 30 μg por dosis para su uso como medicamento humano.

2. La composición inmunogénica para uso de acuerdo con la reivindicación 1 para pa prevención de infección y/o enfermedad por citomegalovirus.

3. La composición inmunogénica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el adyuvante comprende adicionalmente un esterol y en la que la relación de saponina:esterol es de 1:1 a 1:100 p/p.

4. La composición inmunogénica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha fracción de saponina inmunológicamente activa es QS21.

5. La composición inmunogénica para su uso según la reivindicación 3, en la que dicho esterol es colesterol.

6. La composición inmunogénica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho lipopolisacárido es un derivado de lípido A.

7. La composición inmunogénica para su uso según la reivindicación 6, en la que dicho derivado de lípido A e.

3. MPL.

8. La composición inmunogénica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha saponina es QS21 y el lipopolisacárido e.

3. MPL y cada uno de QS21 .

3. MPL está presente a un nivel de entr.

2. 30 μg por dosis.

9. La composición inmunogénica para su uso según la reivindicación 8, en la que QS21 .

3. MPL están presentes a un nivel de 25 μg por dosis.

10. La composición inmunogénica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha saponina es QS21 y el lipopolisacárido e.

3. MPL y cada uno de QS21 .

3. MPL está presente a un nivel de entre 5-15 μg por dosis.

11. La composición inmunogénica según la reivindicación 10, en la que QS21 .

3. MPL están presentes a un nivel de 10 μg por dosis.

12. La composición inmunogénica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el antígeno de CMV es un antígeno humano.

13. La composición inmunogénica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el antígeno del CMV es gB o derivados del mismo.

Figura 1 –

MPL® en polvo ↓ Suspensión (10 mg/ml) ↓ Tratamiento térmico ↓ Enfriamiento ↓ Microfluidización ↓ Dilución a 2 mg/ml ↓ Prefiltración en 0, 65 μm ↓ Filtración en 0, 2 μm ↓ Dilución a 1 mg/ml ↓ Almacenamiento a +2/+8ºC

Figura 2 – Inmunidad humoral contra diversas cepas de gripe después de la inmunización de hurones con formulaciones experimentales (Ensayo de Inhibición de la Hemaglutinación (GMT +/-IC95)

60Figura 3 – Estudio con hurones: titulación viral en lavados nasales después de la estimulación (Día 42) .

Figura 4 – Estudio con ratones: Respuesta humoral contra las tres cepas de vacuna de gripe después de lainmunización de ratones con formulaciones experimentales: Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (GMT +/-IC95) 21 días después de la inmunización Figur.

6. Estudio con ratones: CMI para CD4 -Cepa combinada (todo doble) -Día 0 y Día 21

Figur.

7. GMT en los días 0 y 21 para anticuerpos HI

Figura 8 Frecuencia de síntomas locales y generales en seres humanos (total y relacionada con el grado 3) durante el periodo de seguimiento de 7 días % de síntomas reseñados (con IC 95%)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

Síntomas generales Síntomas locales

Flu YNG Rel. de grado 3Flu ELD

Rel. de grado 3 AS01B

Rel. de grado 3 AS01E

Rel. de grado 3

Flu YNGRel. de grado 3 Flu ELDRel. de grado 3 AS01BRel. de grado 3 AS01E Rel. de grado 3

Grupo de vacuna Figura 9: Respuestas humorales a VPH 16 y 18 L1

Figura 11: Producción de células B de memoria específicas después de la inmunización con formulaciones de VPH potenciadas con adyuvante, .

0, 0 0, 5 1, 0% 1, 5% 2, 0 2, 5 3, 0 3, 5 4, 0 4, 5Frecuencia de células B de memoria específicasde VLP 16 en la memoria IgG total 2μg 0, 5μg AS04 1/10 2μg 0, 5μg 1/50 2μg 0, 5μg 2μg 0, 5μg GMT +/-AS01B 1/10 1/50

Figura 15: Títulos de ELISA Anti-gB en Ratones después de la inmunización con vacuna gB potenciada con adyuvante.

Figura 17: Estudio con ratones: Inmunidad mediada por células -Células CD4+ y CD8+ específicas para CMV después de la re-estimulación con una reserva de péptidos gB (7 días después de la segunda inmunización)

Figura 18: Estudio con ratones. Inmunidad Mediada por Células -Células CD4+ específicas para CMV después de la re-estimulación con dos dosificaciones diferentes de una reserva de péptidos gB (21 días después de la segunda inmunización) .

Figura 19: Estudio con ratones. Inmunidad Mediada por Células -Células CD8+ específicas para CMV después de la re-estimulación con dos dosificaciones diferentes de una reserva de péptidos gB (21 días después de la segunda inmunización) .

Figura 20: Títulos de anticuerpo en media geométrica (GMT) contra proteína de Circumsporozoito CSP después de la inmunización con vacuna RTS, S potenciada con adyuvante en ratones.

Nota: Los resultados se presentan como la media geométrica de los títulos de Ac anti-CSP de los grupos de ratones de dos experimentos y sus límites de confianza del 95%.

Figura 23: Expresión ex vivo de IL-2 y/o IFN gamma por células T CD4 y CD8 específicas para HB.

Figura 24: Respuestas humorales en ratones después de la inmunización con vacuna contra la gripe dividida trivalente potenciada con adyuvante (inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes)

Figura 25: Respuesta inmunitaria mediada por células en ratones después de inmunización con vacuna contra la gripe con adyuvante (inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes)