Composición de superóxido dismutasa lecitinazada y un procedimiento para su producción.

Una composición de superóxido dismutasa lecitinizada, que comprende una superóxido dismutasa lecitinizadaobtenida por sustitución de al menos un grupo amino en la superóxido dismutasa humana coordinada con cobre y/ozinc que tiene un grupo hidroxietiltio en lugar del grupo mercapto en la cisteína de la posición 111,

con al menos unresto de lecitina representado por la fórmula siguiente (I):

[en donde R es un grupo alquilo de C8-30, y n es un número entero de 2 a 10], que está disuelto en alcoholisopropílico, en donde el resto de lecitina se hace reaccionar con 0,05 a 0,4 veces los moles de dicha superóxidodismutasa, en donde la superóxido dismutasa lecitinizada comprende, como componente principal, una superóxidodismutasa lecitinizada (A) que tiene un número m de grupos amino sustituidos con restos de lecitina [en donde m esun número entero de 1 a 4 y tiene un valor medio de 1,5 a 2,4], y la superóxido dismutasa lecitinizada (A) consisteen 25 a 40 % en moles de una superóxido dismutasa lecitinizada (a1) en donde m ≥ 1, de 35 a 50 % en moles deuna superóxido dismutasa lecitinizada (a2) en donde m ≥ 2, de 10 a 20 % en moles de una superóxido dismutasalecitinizada (a3) en donde m ≥ 3 y de 5 a 15 % en moles de una superóxido dismutasa lecitinizada (a4) en donde m15 ≥ 4.

Composición de superóxido dismutasa lecitinizada y un procedimiento para su producción.

La presente invención se refiere a una composición de superóxido dismutasa lecitinizada y a un procedimiento para su producción.

Las superóxido dismutasas (en lo sucesivo denominadas simplemente SOD) son enzimas presentes en una amplia variedad de organismos, tales como animales, plantas y microorganismos. Las SOD catalizan la dismutación de la especie de oxígeno reactiva libre denominada radical anión superóxido. Se espera utilizar las SOD como un fármaco anti-reumático, como un agente terapéutico para enfermedades autoinmunitarias e infarto de miocardio, durante el trasplante de órganos, para la eliminación de radicales generados in vivo mediante el uso de agentes antitrombóticos después de un infarto cerebral y para los diversos tipos de inflamación (documento que no es patente 1) .

Se han propuesto varios derivados de SOD. Por ejemplo, se propone como fármaco (documento de patente 1) una superóxido dismutasa lecitinizada (denominada de aquí en adelante PC-SOD) con una capacidad de acumulación muy mejorada en las lesiones diana y una estabilidad in vivo muy mejorada obtenida tratando con lecitina una SOD

específica.

Documento de patente 1: Patente japonesa Nº 3070980.

Documento que no es patente 1: "Kasseisanso-no Rinsho-heno Tembo (Clinical Review of Active Oxygen) ", editado por Naoyuki Taniguchi, publicado por Iyaku Journal Co., Ltd., Tokyo, pp. 61-111 (1994) .

Además, la Patente de EE.UU. 5.762.929 describe un agente anti-enfermedad de las motoneuronas, que comprende 20 superóxido dismutasa conjugada con lecitina por reticulación química.

Sin embargo, el uso médico práctico de la PC-SOD presenta algunos problemas. Por ejemplo, la PC-SOD obtenida convencionalmente haciendo reaccionar una SOD específica con un derivado de lecitina tiene el problema de actividad enzimática inestable que puede provocar trastornos cuando se fórmula en preparaciones o después de dicha formulación. Además, por el procedimiento convencional no se obtiene con rendimientos suficientemente altos.

El objeto de la presente invención es proporcionar una composición de PC-SOD con buena estabilidad que sea útil como fármaco.

Como resultado de su amplia investigación, los autores de la presente invención encontraron que una composición de PC-SOD que contiene, como componente principal, una PC-SOD (A) obtenida sustituyendo de 1 a 4 grupos amino en una SOD específica con restos de lecitina (de aquí en adelante denominada PC-SOD (A) ) resuelve los problemas antes mencionados. Además, estudiaron las condiciones para la producción de la composición de PC-SOD y encontraron que la composición de PC-SOD se puede obtener con altos rendimientos haciendo reaccionar un derivado de lecitina con una SOD específica en una relación específica y aislando el producto de reacción por un proceso específico.

Concretamente, la presente invención proporciona una composición de PC-SOD que contiene una PC-SOD

obtenida sustituyendo al menos un grupo amino en superóxido dismutasa humana coordinada con cobre y/o zinc que tiene un grupo hidroxietiltio en lugar del grupo mercapto en la cisteína de la posición 111, con al menos un resto de lecitina representado por la siguiente fórmula (I) :

(en donde R es un grupo alquilo de C8-30 y n es un número entero de 2 a 10) , que está disuelto en alcohol isopropílico, en donde el resto de lecitina se hace reaccionar con 0, 05 a 0, 4 veces los moles de dicha superóxido dismutasa, en donde la PC-SOD comprende, como componente principal, una PC-SOD (A) que tiene un número m de grupos amino sustituidos con restos de lecitina (en donde m es un número entero de 1 a 4 y como valor medio de 1, 5 a 2, 4) y la PC-SOD (A) consiste en 25 a 40% en moles de una superóxido dismutasa lecitinizada (a1) en donde m = 1, de 35 a 50% en moles de una superóxido dismutasa lecitinizada (a2) en donde m = 2, de 10 a 20% en moles de una superóxido dismutasa lecitinizada (a3) en donde m = 3 y de 5 a 15% en moles de una superóxido dismutasa lecitinizada (a4) en donde m = 4.

La presente invención proporciona también un procedimiento para producir la composición de superóxido dismutasa lecitinizada definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende una etapa de lecitinación haciendo reaccionar un derivado de lecitina representado por la siguiente fórmula (III) :

(en donde R es un grupo alquilo de C8-30, Z es un grupo hidroxilo o un grupo formador de éster activo que elimina un grupo carbonilo y n es un número entero de 2 a 10) que está disuelto en alcohol isopropílico, con 0, 5 a 0, 4 veces los moles de superóxido dismutasa humana coordinada con cobre y/o zinc que tiene un grupo hidroxietiltio en lugar del grupo mercapto en la cisteína de la posición 111, para obtener una PC-SOD en bruto, y una etapa de purificación en la que se purifica la PC-SOD en bruto por cromatografía en columna de intercambio iónico.

La composición de PC-SOD de la presente invención tiene una actividad enzimática estable y una alta estabilidad in vivo y es fácil de formular en una preparación. Por consiguiente, es útil como fármaco. Por el procedimiento de la presente invención se obtiene la composición de PC-SOD con altos rendimientos.

La composición de PC-SOD de la presente invención contiene una PC-SOD que tiene una estructura de superóxido dismutasa humana coordinada con cobre y/o zinc (denominada de aquí en adelante SOD humana) que tiene un grupo hidroxietiltio en lugar del grupo mercapto en la cisteína de la posición 111, y tiene al menos un grupo amino sustituido con un resto de lecitina representado por la siguiente fórmula (I) .

La SOD utilizada para producir la PC-SOD se puede obtener por cualquier método sin restricciones particulares y puede ser de origen humano u otro origen. Especialmente, la SOD humana puede ser de cualquier origen siempre que tenga la misma estructura que la SOD de origen humano.

En la presente invención, la PC-SOD consiste en una PC-SOD (A) que se describirá más adelante y una PC-SOD

(B) (denominada de aquí en adelante PC-SOD (B) ) obtenida sustituyendo al menos 5 grupos amino en la SOD humana con restos de lecitina (I) . El total de las PC-SOD significa la suma de la PC-SOD (A) y la PC-SOD (B) .

En el resto de lecitina representado por la fórmula (I) (denominado de aquí en adelante el resto de lecitina (I) ) , R es un grupo alquilo de C8-30, preferiblemente un grupo alquilo de C14-22. R puede ser lineal o ramificado, preferiblemente lineal. R es preferiblemente un grupo alquilo lineal de 13, 15 o 17 átomos de carbono, particularmente un grupo alquilo lineal de C15.

n es un número entero de 2 a 10, preferiblemente de 2 a 6, particularmente con preferencia 3.

En la presente invención, la PC-SOD en la composición de PC-SOD se refiere genéricamente a compuestos obtenidos sustituyendo al menos un grupo amino en la SOD humana con un resto de lecitina. Debido a que la SOD humana tiene 12 grupos amino, la PC-SOD tiene de 1 a 12 restos de lecitina (I) .

"Sustituido con un resto de lecitina (I) " significa que cualquier átomo de hidrógeno de un grupo amino (-NH2) está sustituido por un resto de lecitina.

La composición de PC-SOD de la presente invención contiene, como componente principal, una PC-SOD (A) , en donde el número (m) de restos de lecitina (I) es un número entero de 1 a 4, y el valor medio de m es de 1, 5 a 2, 4. m es el número de restos de lecitina en los grupos amino en la PC-SOD (A) . "Que contiene, como componente principal, la PC-SOD (A) " significa que entre las PC-SOD en la composición de PC-SOD, la PC-SOD (A) constituye la mayor proporción. La relación entre la PC-SOD (A) y el total de las PC-SOD es preferiblemente al menos 75% en masa, particularmente del 85 al 100% en masa.

Además, en la presente invención, la PC-SOD (A) contiene cuatro tipos de PC-SOD, en donde m es 1, 2, 3 y 4, en relaciones específicas, respectivamente. Especialmente, la PC-SOD (A) consiste en 25 a 40% en moles de una PC-SOD (a1) en donde m = 1, de 35 a 50% en moles de una PC-SOD (a2) en donde m = 2, de 10 a 20% en moles de una PC-SOD (a3) en donde m = 3 y de 5 a 15% en moles de una PC-SOD (a4) en donde m = 4.

El valor medio de m es de 1, 5 a 2, 4. El valor medio de m se calcula sobre una base molar a partir de las relaciones molares entre las PC-SOD (a1) , (a2) , (a3) y (a4) y la cantidad total.

Cuando el número de restos de lecitina unidos a la PC-SOD es grande, la PC-SOD es muy hidrófoba y por consiguiente adherente a las células y fácilmente absorbida por los tejidos adiposos. Por... [Seguir leyendo]

1. Una composición de superóxido dismutasa lecitinizada, que comprende una superóxido dismutasa lecitinizada obtenida por sustitución de al menos un grupo amino en la superóxido dismutasa humana coordinada con cobre y/o zinc que tiene un grupo hidroxietiltio en lugar del grupo mercapto en la cisteína de la posición 111, con al menos un resto de lecitina representado por la fórmula siguiente (I) :

[en donde R es un grupo alquilo de C8-30, y n es un número entero de 2 a 10], que está disuelto en alcohol isopropílico, en donde el resto de lecitina se hace reaccionar con 0, 05 a 0, 4 veces los moles de dicha superóxido dismutasa, en donde la superóxido dismutasa lecitinizada comprende, como componente principal, una superóxido 10 dismutasa lecitinizada (A) que tiene un número m de grupos amino sustituidos con restos de lecitina [en donde m es un número entero de 1 a 4 y tiene un valor medio de 1, 5 a 2, 4], y la superóxido dismutasa lecitinizada (A) consiste en 25 a 40 % en moles de una superóxido dismutasa lecitinizada (a1) en donde m = 1, de 35 a 50 % en moles de una superóxido dismutasa lecitinizada (a2) en donde m = 2, de 10 a 20 % en moles de una superóxido dismutasa lecitinizada (a3) en donde m = 3 y de 5 a 15 % en moles de una superóxido dismutasa lecitinizada (a4) en donde m

= 4.

2. La composición de superóxido dismutasa lecitinizada de acuerdo con la reivindicación 1, que contiene una superóxido dismutasa lecitinizada (B) que tiene al menos 5 grupos amino sustituidos con restos de lecitina representados por la fórmula (I) .

3. La composición de superóxido dismutasa lecitinizada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la relación

entre la superóxido dismutasa lecitinizada (A) y el total de superóxido dismutasas lecitinizadas medida por cromatografía de líquidos de alta eficacia (en términos de superficie de los picos en el cromatograma) es al menos 85%.

4. La composición de superóxido dismutasa lecitinizada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la relación entre la superóxido dismutasa lecitinizada (A) y el total de superóxido dismutasas lecitinizadas medida por electroforesis sobre dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida (en términos de superficie de los picos en el cromatograma) es al menos 80%.

5. La composición de superóxido dismutasa lecitinizada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene una actividad específica del al menos 2000 unidades por 1 mg del total de superóxido dismutasas lecitinizadas medida por el método de citocromo C.

6. La composición de superóxido dismutasa lecitinizada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que contiene de 0, 01 a 0, 15 nmol de un ácido graso representado por la fórmula (II) por 1 mg del total de superóxido dismutasas lecitinizadas:

RCOOH (II)

[en donde R es un grupo alquilo de C8-30].

7. La composición de superóxido dismutasa lecitinizada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que contiene la superóxido dismutasa lecitinizada (A) en forma de un dímero de superóxido dismutasas lecitinizadas que tienen el mismo o diferente m.

8. Un procedimiento para producir la composición de superóxido dismutasa lecitinizada definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende una etapa de lecitinación consistente en hacer reaccionar un derivado 40 de lecitina representado por la fórmula siguiente (III) :

[en donde R es un grupo alquilo de C8-30, Z es un grupo hidroxilo o un grupo formador de éster activo que elimina un grupo carbonilo, y n es un número entero de 2 a 10) que está disuelto en alcohol isopropílico con 0, 05 a 0, 4 veces los moles de superóxido dismutasa humana coordinada con cobre y/o zinc que tiene un grupo hidroxietiltio en lugar

del grupo mercapto en la cisteína de la posición 111 para obtener una superóxido dismutasa lecitinizada en bruto, y una etapa de purificación de la superóxido dismutasa lecitinizada en bruto por cromatografía en columna de intercambio iónico.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la etapa de purificación se lleva a cabo permitiendo que la superóxido dismutasa lecitinizada en bruto obtenida en la etapa de lecitinación sea adsorbida sobre una resina de intercambio iónico, eluyendo luego la superóxido dismutasa lecitinizada que no ha reaccionado con el siguiente disolvente (A) y eluyendo la composición de superóxido dismutasa lecitinizada como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con el siguiente disolvente (B)

disolvente (A) : un disolvente que consiste en 20 a 90 % en volumen de un tampón (a1) , que tiene un pH de 6 a 9 y una concentración de sal inorgánica de 5 a 100 mM, y de 10 a 80 % en volumen de metanol;

disolvente (B) : un disolvente que consiste en 20 a 90 % en volumen de un tampón (b1) , que tiene un pH de 6 a 9 y una concentración de sal inorgánica de 150 a 400 mM, y de 10 a 80 % en volumen de metanol.