Complejo que comprende un microvehículo que tiene una carga positiva conjugada con una marca cargada negativamente, cuya marca es una microesfera, cuya microesfera no está revestida con proteínas, y usos del mismo.

Un complejo que comprende un microvehículo que tiene una carga positiva conjugada a una marca con carganegativa,

marca que es una microesfera, microesfera que no está revestida con proteínas, en el que dichomicrovehículo comprende proteína, celulosa, polietileno, polistirol, vidrio, colágeno, colágeno-glucosa-5 aminoglucanoy/o gelatina.

Complejo que comprende un microvehículo que tiene una carga positiva conjugada con una marca cargada negativamente, cuya marca es una microesfera, cuya microesfera no está revestida con proteínas, y usos del mismo 5

Campo de la invención La presente invención se refiere ampliamente a un cultivo celular -tal como el cultivo de células primarias, estirpes celulares, células pluripotentes, células totipotentes no humanas y células pluripotentes excluyendo células pluripotentes embrionarias humanas.

Antecedentes de la invención Durante los últimos años el cultivo celular se ha convertido en una tecnología principal en las ciencias de la vida. El

cultivo celular se describe en "Basic Cell Culture" Oxford University Press (2002) Ed. J. M. Davis; y "Animal Cell Culture" Oxford University Press (2000) Ed. John R. W. Masters; ambos incorporados en la presente memoria por referencia en su totalidad. El cultivo celular proporciona la base para el estudio de procesos celulares tales como la viabilidad, fenotipo, genotipo, proliferación y diferenciación de células y la formación de moléculas biológicas, intermedios y productos. También se ha proporcionado el medio para el estudio de la proliferación de estos procesos, a partir del nivel genérico -ya sea en aislamiento ya sea en animales completamente transgénicos- en sentido descendente hasta el nivel de moléculas de proteínas individuales. A pesar de su enorme contribución al estado actual de la biología, muchos cultivos celulares conservan una disciplina de desarrollo, a pesar de la ciencia inusualmente interesante que últimamente ofrece la posibilidad de terapia genética e ingeniería tisular.

Un objetivo importante del cultivo celular es la capacidad para generar la proliferación de una amplia variedad de células in vitro. El listado de tipos celulares diferentes que se pueden dejar proliferar en un cultivo es amplio (véase la colección American-Type Culture, http://www.atcc.org; European Collection of Cell Cultures, http:/www.ecacc.org.uk; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH-, http://www.dsmz.de) , incluye ejemplos de la mayoría de los tipos celulares y está aumentando de forma continua a medida que se descubren más y más condiciones de cultivo. A pesar del progreso actual en el campo, el método de determinación de las condiciones de cultivo apropiadas para nuevos tipos celulares sigue siendo totalmente empírico; las condiciones de proliferación se descubren casi siempre por medio de ensayo y error. La elección del punto de partida con frecuencia está basada en las que se han usado previamente por parte de otros para células similares, o incluso en las que se usan actualmente en el laboratorio para diferentes células. Muchas veces, estas son simples y

completamente inapropiadas y se debe iniciar un nuevo proceso de ensayo de error. Incluso cuando las condiciones de un nuevo cultivo son satisfactorias, merece la pena recordar que las adaptaciones de los protocolos anteriores han introducido un sesgo histórico al experimento. Por ejemplo, muchos de los experimentos preliminares con cultivos tisulares hicieron extensivo el uso de fibroblastos y hasta la fecha la mayoría de las condiciones normalizadas de cultivos celulares favorecen la proliferación de células procedentes del mesodermo (fibroblastos, endotelio, mioblastos) . El desarrollo de un medio de proliferación selectivo para las células epiteliales y otros tipos de células basadas en estas condiciones constituyó un reto. Para algunos de los tipos celulares, se sabe que el suero un componente normal de muchos medios de cultivo para células mesodérmicas- realmente inhibe la proliferación. Un aspecto de la invención descrito en la presente memoria es un método para desarrollar condiciones de cultivo apropiadas que permitan la viabilidad, proliferación y retención del fenotipo de tipos celulares particulares.

Algunos problemas comunes que todavía se encuentran en los cultivos celulares son la vida útil limitada de las estirpes celulares primarias, el cambio de las características de las estirpes celulares con el paso y su transformación acompañada por la pérdida de características celulares interesantes. Estos efectos limitan en gran medida la utilidad de las células cultivadas para su uso en experimentos o ensayos, por ejemplo los ensayos basados en células descritos a continuación. Las células primarias, es decir, células aisladas de nuevas a partir de tejidos, ofrecen con mucho los modelos de cultivo celular más precisos, ya que se comportan de una forma que se parece ampliamente a su tejido de origen. De manera marcada, aún no se ha desarrollado un método de cultivo fiable de células primarias y por consiguiente estas células exhiben una vida útil limitada in vitro. Esto supone una limitación técnica importante, por ejemplo cuando se intenta ampliar el cultivo primario, o cuando se intenta llevar a 55 cabo un experimento a un plazo más largo. Un problema adicional asociado al uso de cultivos primarios es que debido a que requieren aislamiento nuevo constante, puede resultar difícil disponer de materia primaria como fuente, en particular procedente de humanos y también es difícil obtener estirpes que se comporten de manera consistente. Un tercer aspecto de la invención es por tanto un método para cultivar células primarias con el fin de obtener cultivos viables con una vida útil prolongada.

Si se mantienen los cultivos primarios in vitro durante un periodo amplio, normalmente experimentan una crisis en la que la mayoría de las células perecen, sin embargo las células que sobreviven tienen una vida más larga y se pueden cultivar de forma indefinida. La mayoría de estas estirpes celulares son casi invariablemente representaciones pobres de la células y se descubren en tejidos animales intactos. Un motivo para esto se basa en 65 el hecho de que el proceso que permite a las células convertirse en inmortales también tiene un impacto sobre las características de la célula. Por ejemplo, la mayoría de los cultivos celulares estabilizados han detenido sus genes específicos tisulares de expresión y en lugar de ello, únicamente expresan genes de verificación necesarios para la proliferación continua en el cultivo celular -como resultado de ello la mayoría de las citadas estirpes celulares son más parecidas unas a otras que el tejido del que proceden de forma original. Por ejemplo, la mayoría de las células hepáticas han detenido la expresión de enzimas que metabolizan fármacos que, normalmente, las convertiría en herramientas interesantes para someter a ensayo la toxicidad del fármaco. Otro aspecto de la invención descrito en la presente memoria es un método de cultivo de células de forma que proporcionen modelos de tejidos más precisos. Esto a su vez mejoraría la fiabilidad y el poder de predicción de los experimentos basados en células y los ensayos.

Las técnicas mejoradas para el cultivo de células y los métodos para descubrir y poner en práctica dichas técnicas para la regulación de procesos celulares tales como la proliferación, diferenciación, actividad metabólica y expresión fenotípica se presentan en la solicitud internacional en trámite junto con la presente WO 2004/031369. Cuando se manejan números grandes de unidades celulares, su identidad y/o historia de cultivo celular (por ejemplo, la cronología y la naturaleza exacta de una serie de condiciones de cultivo a las que un grupo o unidad cualquiera ha podido estar expuesto) se pueden confundir. El documento WO 2004/031369 describe métodos mejorados para determinar la identidad y/o la historia de cultivo celular de las unidades celulares. En un aspecto, se describe el uso de unidades celulares que se pueden manejar de forma apropiada en los experimentos de biología celular, permitiendo por ejemplo la separación y la agrupación de dichas unidades.

La presente invención pretende proporcionar mejoras adicionales que solucionen algunas de las limitaciones de la técnica anterior.

Sumario de la invención En la presente memoria se describe un método para determinar la historia de cultivo celular de una unidad celular marcada con más de una marca (por ejemplo, tipo de marca) que comprende las etapas de: (a) medir uno o más parámetros de cada marca que se usa para marcar la unidad celular; (b) identificar cada marca de la unidad celular; y (c) correlacionar la identidad de cada marca para identificar la unidad celular y/o las condiciones de cultivo celular específicas a las que se ha expuesto la unidad celular.

También se muestra en la presente memoria un producto de programa de ordenador que incluye un programa de ordenador para controlar un ordenador con el fin de llevar a cabo el método descrito.

Se muestra... [Seguir leyendo]

1. Un complejo que comprende un microvehículo que tiene una carga positiva conjugada a una marca con carga negativa, marca que es una microesfera, microesfera que no está revestida con proteínas, en el que dicho microvehículo comprende proteína, celulosa, polietileno, polistirol, vidrio, colágeno, colágeno-glucosa-aminoglucano y/o gelatina.

2. El complejo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el microvehículo es un microvehículo poroso.

3. El complejo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el microvehículo consiste esencialmente en proteína, celulosa, polietileno, polistirol, vidrio, colágeno, colágeno-glucosa-aminoglucano y/o gelatina.

4. El complejo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la microesfera tiene un diámetro de aproximadamente 9

μm o menos. 15

5. El complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la marca comprende, consiste o consiste esencialmente en poliestireno y/o látex.

6. El complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el complejo se adhiere o se une a al 20 menos una célula.

7. El complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que al menos un anticuerpo está ligado a la célula.

8. Un método para separar el complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende las etapas de poner en contacto dicho complejo con un ácido, una proteasa o una celulasa.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el ácido está seleccionado entre ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o hipoclorito de sodio. 30

10. El método de la reivindicación 8 o 9, en el que se detecta la marca separada.

11. El método de la reivindicación 10, en el que la marca se somete a análisis de imágenes.

12. Un método para determinar el efecto de una pluralidad de condiciones de cultivo sobre una célula que comprende el uso de un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

13. Un método para determinar el efecto de una pluralidad de condiciones de cultivo sobre una célula, que comprende las etapas de: 40

(a) proporcionar un primer conjunto de grupos de una o más células y exponer dicho primer conjunto de grupos a condiciones de cultivo deseadas,

(b) agrupar dos o más de dichos grupos para formar al menos una segunda agrupación, 45

(c) subdividir la segunda agrupación para crear un conjunto adicional de grupos de una o más células,

(d) exponer dichos grupos adicionales a condiciones de cultivo deseadas, 50 (e) opcionalmente, repetir las etapas (b) - (d) iterativamente según se requiera, y

(f) evaluar el efecto de las condiciones de cultivo a las que se ha expuesto una célula o grupo de células concreto;

en el que cada grupo de una o más células es adherente a, o se une por medio de, un complejo de acuerdo con 55 cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

14. Un método para exponer un célula a una variedad de condiciones de cultivo celular, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un primer conjunto de grupos de una o más células y exponer dichos grupos a condiciones de cultivo deseadas,

(b) agrupar dos o más de dichos grupos para formar al menos una segunda agrupación, 65 (c) subdividir la segunda agrupación para crear un conjunto adicional de grupos de una o más células,

(d) exponer dichos grupos adicionales a condiciones de cultivo deseadas, y

(e) opcionalmente, repetir las etapas (b) - (d) iterativamente según se requiera;

en el que cada grupo de una o más células es adherente a, o se une por medio de, un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que las condiciones de cultivo son medios a los que se ha expuesto la célula. 10

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el medio contiene uno o más agentes específicos que influyen en un proceso celular.

17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-16, en el que las condiciones de cultivo celular 15 comprenden cultivar a una o más temperaturas específicas.

18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-17, en el que las condiciones de cultivo celular comprenden cultivar sobre uno o más sustratos específicos.

19. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-18, en el que el proceso celular es proliferación o diferenciación celular.

20. Un método para cultivar células pluripotentes excluyendo células pluripotentes embrionarias humanas o células que proceden de células pluripotentes in vitro que comprende las etapas de:

a) incubar un cultivo de células pluripotentes, y

b) separar dicho cultivo en dos o más grupos de células pluripotentes y cultivar dicho grupo de células pluripotentes en dos o más conjuntos diferentes de condiciones de cultivo;

en el que las células se cultivan en grupos que comprenden una o más células adheridas o unidas en el complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

21. Un método para cultivar células pluripotentes, excluyendo células pluripotentes embrionarias humanas, que comprende dejar proliferar dichas células pluripotentes adheridas al complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en el que dichas células pluripotentes se someten a al menos un cambio de las condiciones de cultivo. 40

23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho cambio de las condiciones de cultivo comprende un cambio de medio.

24. Un método para obtener células diferenciadas a partir de células pluripotentes in vitro, que comprende las etapas 45 de:

(a) dejar proliferar las células pluripotentes, excluyendo células pluripotentes embrionarias humanas, adherentes al complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en un medio de cultivo;

(b) transferir el complejo de un medio de cultivo a otro;

(c) opcionalmente repetir la etapa (b) según se requiera; y

(d) obtener las células diferenciadas unidas al complejo. 55

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que las células diferenciadas se aíslan por medio de desligado enzimático o químico del complejo.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 24 o 25, en el que las células diferenciadas se aíslan por medio de 60 digestión del complejo.

27. Un método para dejar proliferar células pluripotentes pluripotentes, excluyendo células pluripotentes embrionarias humanas, in vitro que comprende las etapas de:

(a) sembrar dichas células sobre el complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8; y (b) propagar las células mientras se encuentran unidas al complejo.

28. Un método para cultivar células, excluyendo células pluripotentes embrionarias humanas, in vitro, que comprende dejar proliferar dichas células adheridas al complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1

7.

29. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-28 que comprende adicionalmente separar las marcas del complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

30. El método de la reivindicación 29, en el que las marcas se separan exponiendo al complejo a un ácido, una proteasa o una celulasa.

31. El método de acuerdo con la reivindicación 29 o 30, en el que las marcas separadas se someten a análisis de imágenes. 15

32. Uso de un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para determinar el efecto de una pluralidad de condiciones de cultivo sobre una célula.

33. El uso de acuerdo con la reivindicación 32, que comprende adicionalmente separar las marcas del complejo de 20 cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

34. El uso de acuerdo con la reivindicación 33, en el que las marcas se separan exponiendo el complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 a un ácido, una proteasa o una celulasa.

35. El uso de acuerdo con la reivindicación 33 o 34, en el que las marcas separadas se someten a análisis de imágenes.

36. El complejo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en el que la microesfera es una microesfera modificada con carboxilato.