Procedimiento de citometría de flujo para la determinación del número total de leucocitos y del número de trombocitos, así como para la diferenciación de leucocitos en muestras de sangre de aves.

Procedimiento para la determinación del número total de leucocitos en la sangre de aves o gallináceas,

que comprende las etapas:

(a) habilitación de una muestra de sangre no coagulada,

(b) eventualmente, fijación de la muestra,

(c) dilución de la muestra,

(d) puesta en contacto de la muestra diluida con un marcador de pan-leucocitos y un marcador de trombocitos,

(e) medición de la muestra en un citómetro de flujo sin etapas de lavado ni purificación previas y

(f) determinación cuantitativa de la población de leucocitos así como de la población de trombocitos en la muestra.

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Procedimiento de citometria de flujo para la determinacion del numero total de leucocitos y del numero de trombocitos, asi como para la diferenciacion de leucocitos en muestras de sangre de aves La presente invencion se refiere a un procedimiento para la determinacion del numero total de leucocitos y del numero de trombocitos, asi como para la diferenciacion de leucocitos en la sangre de aves, utilizando marcadores de pan-leucocitos y trombocitos marcados por fluorescencia y/u otros marcadores de leucocitos, sin una previa separacion de eritrocitos. El hemograma de globulos rojos y de globulos blancos se establece rutinariamente en la medicina humana y de mamiferos con el fin de examinar el estado de salud de individuos y poblaciones. Variaciones en la hemostasis de los leucocitos se representan en el hemograma de globulos blanco (leucograma) . Este contiene la determinacion del numero total de leucocitos, el hemograma diferencial, el calculo de los numeros absolutos de las diferentes fracciones de leucocitos por 1l de sangre y la valoracion morfologica de los leucocitos en el frotis de sangre tefido. El leucograma proporciona al clinico una idea sobre el estado actual del sistema inmunologico de pacientes. Dado que los numeros de leucocitos en el caso de individuos sanos son relativamente constantes, pero varian probablemente de manera intensa en el caso de la presencia de una enfermedad, el hemograma de globulos blancos tiene una funcion indicadora. Las respuestas de leucocitos no son, por norma general, ciertamente patognomicas (consideradas por si solas, ya suficientes para un seguro establecimiento de diagnostico) . Sin embargo, pueden proporcionar valiosas informaciones que ayudan a establecer un diagnostico de sospecha, confirmar un diagnostico diferencial, vigilar el exito de una terapia o emitir un pronostico. Variaciones del hemograma de globulos blanco arrastran tras de si en el dia a dia clinico, en ocasiones, consecuencias terapeuticas directas, p. ej. en forma de un tratamiento antibiotico. Finalmente, la mayoria de las veces son uno de los primeros indicios de diagnostico del laboratorio sobre la presencia de infecciones que amenazan la vida. La determinacion del numero total de leucocitos y del hemograma diferencial pertenece a los ensayos de laboratorio llevados a cabo con mayor frecuencia en la medicina humana. En virtud de la elevada precision, exactitud y rapidez de los aparatos de analisis de hematologia automaticos, estos ensayos se llevan a cabo entretanto de manera predominante de forma automatizada en la medicina humana. Solamente las muestras, en cuyo analisis fracase el aparato o en las que este, en virtud de particularidades, requiera una verificacion, se valoran al microscopio. En contraposicion a la hematologia en mamiferos, la hematologia de aves se sigue encontrando todavia en sus comienzos. Se describio la morfologia de las celulas de la sangre de las aves y se desarrollaron tecnicas manuales para el recuento de leucocitos. Sin embargo, se impidieron avances decisivos en la hematologia de las aves, dado que faltan procesos de ensayo automatizados. Ninguno de los procedimientos automatizados establecidos en la hematologia de mamiferos es adecuado para el ensayo de la sangre de aves. Los motivos de ello se encuentran en la particular constitucion de las celulas de la sangre de las aves. En el caso del recuento de leucocitos en aparatos de analisis de hematologia, los eritrocitos perturbadores son lisados habitualmente mediante la adicion de cloruro de amonio o disoluciones hipotonicas. Sin embargo, los eritrocitos de las aves, al igual que los de todos los vertebrados no pertenecientes a los mamiferos (reptiles, anfibios, peces, etc.) contienen un nucleo, pero solo se pueden lisar dificilmente y durante la medicion no se pueden diferenciar de manera fiable de leucocitos. Ademas, en el caso de los trombocitos de las aves, a diferencia de las plaquetas sanguineas de los mamiferos, se trata de celulas nucleadas del tamafo de los linfocitos, las cuales los aparatos de analisis de hematologia no permiten tampoco diferenciar de manera fiable de los leucocitos. En la bibliografia se sefala, ademas, que junto a eritrocitos y trombocitos intactos, los nucleos que se liberan durante una lisis de los eritrocitos conducen tambien a interferencias. Los procedimientos de recuento de particulas electronicos habituales y los procedimientos habituales de recuento en camaras no pueden con ello emplearse para determinar el numero total de leucocitos en la sangre de las aves. Por lo tanto, se desarrollaron numerosos procedimientos manuales para la determinacion del numero total de leucocitos en la sangre de las aves. Sin embargo, todas estas tecnicas requieren mucho tiempo y son imprecisas. El bajo numero de celulas contadas en el caso de los procedimientos de microscopia resulta en un error estadistico elevado. Las dificultades adicionales durante la diferenciacion de leucocitos en la sangre de aves conducen a confusiones y hacen que los procedimientos de microscopia sean todavia menos fiables y mas propensos a errores. Ensayos de adaptar los aparatos disponibles para el recuento y la diferenciacion de leucocitos de sangre de aves

discurrieron predominantemente sin exito. Ciertamente, se informo de resultados satisfactorios en el caso del empleo del aparato de analisis de hematologia Cell-Dyn 3500 de la razon social Abbott Laboratories para examinar la sangre de papagayos, gorriones, aves acuaticas y aves corredoras (Fudge, Abstract in Main Conference Proceedings de la Association of Avian Veterinarians 1995) . El compendio finaliza con la nota de que los datos de precision preliminares dados en la presentacion, que deben ser publicados, serian discutidos. Hasta el momento presente, no se ha podido encontrar, no obstante, publicacion del autor alguna que contuviera informaciones sobre este tema. En un libro editado por el mismo, cinco afos mas tarde, escribe que la tecnologia de la citometria de flujo requeriria todavia de mejoras. Abordando los problemas, declara que para las distintas especies de aves, en virtud de su diferente morfologia de los leucocitos, serian necesarios distintos ajustes de los aparatos. Ademas, se reconocen dificultades en la diferenciacion entre trombocitos y linfocitos.

Otra autora informa incluso que con el aparato Cell-Dyn-3500 no era posible una buena diferenciacion de los leucocitos en linfocitos y granulocitos (Comparacion de metodos de ensayo hematologicos en aves, Diss, Vet. Med. Univ. Viena Reauz, E. 1996) . Unicamente, en la medicion del hematocrito y del numero total de leucocitos se habria alcanzado un resultado satisfactorio. En su trabajo, Reauz ha examinado sangre de aves con todavia otro aparato automatico de hematologia (MS9, Melet Schloesing. Francia) . En este caso, para los parametros hematocrito, numero de eritrocitos, numero total de leucocitos, linfocitos, monocitos y granulocitos se habrian alcanzado valores que coincidirian bien con los resultados determinados con los metodos convencionales. No pudieron, sin embargo, encontrarse publicaciones que fueran mas alla sobre el empleo de este aparato para el examen de sangre de aves.

Un examen ulterior de sangre de gallinas con el aparato Cell-Dyn 3500 informa de valores de granulocitos que presentan una exactitud quot;aceptablequot;. A pesar del empleo del software especial VET 2.3 ofrecido por el fabricante, con ajustes especiales para el examen de la sangre de aves, los numeros de linfocitos habrian sido, sin embargo, totalmente imprecisos, toda vez que en el caso de mediciones multiples de las mismas muestras habria que registrar diferencias, en parte considerables, entre los resultados de la medicion. Por lo tanto, el autor tiene pocas esperanzas de que el examen automatizado de sangre de aves pudiera funcionar de manera similarmente bien como en el caso de los mamiferos.

La tecnologia de Capa Leucocitaria Cuantitativa, empleada primeramente en la medicina humana, posibilita tambien en el caso de diferentes animales domesticos una determinacion aproximada rapida del numero total de leucocitos, asi como el establecimiento de un hemograma diferencial. Seidl sometio a ensayo el procedimiento en muestras de sangre de psitacidas. El unico parametro que pudo determinarse de manera fiable en la sangre de aves era, sin embargo, el hematocrito. Como causa de los resultados no satisfactorios en el caso de los otros parametros, no se indica la separacion exacta de las bandas de celulas individuales.

A la vista de las dificultades, hasta ahora no resueltas, en el examen automatizado de la sangre de aves, se continua recurriendo hasta ahora en la medicina de aves, por lo tanto, ampliamente a procedimientos microscopicos laboriosos y no fiables, o se renuncia por completo a estos importantes ensayos hematologicos.

Por lo tanto, existe una demanda... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la determinacion del numero total de leucocitos en la sangre de aves o gallinaceas, que comprende las etapas:

(a) habilitacion de una muestra de sangre no coagulada,

(b) eventualmente, fijacion de la muestra,

(c) dilucion de la muestra,

(d) puesta en contacto de la muestra diluida con un marcador de pan-leucocitos y un marcador de trombocitos,

(e) medicion de la muestra en un citometro de flujo sin etapas de lavado ni purificacion previas y

(f) determinacion cuantitativa de la poblacion de leucocitos asi como de la poblacion de trombocitos en la muestra.

2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que se determinan muestras de sangre entera tratadas con 4 mg/ml de EDTA.

3. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que el marcador de pan-leucocitos se elige de los anticuerpos anti-CD45, 16-6, LT40 y K55, y por que el marcador de trombocitos se elige de los anticuerpos K1, anti-CD41/CD61 y anti-CD51/CD61.

4. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que en la etapa (e) se lleva a cabo, ademas, un analisis de dispersion/difraccion frontal y lateral de las celulas.

5. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que en la etapa (e) se lleva a cabo, ademas, una determinacion de sub-poblaciones de leucocitos.

6. Procedimiento segun la reivindicacion 5, caracterizado por que las sub-poblaciones de leucocitos se eligen de

-monocitos

-celulas T colaboradoras

-celulas T citotoxicas

-celulas T yo

-celulas B

-celulas NK

-granulocitos basofilos

-granulocitos eosinofilos

-granulocitos heterofilos/neutrofilos

-celulas madre y combinaciones de los mismos.