Células madre adultas multipotentes, fuentes de estas, métodos para obtenerlas y mantenerlas, métodos de diferenciación de estas, métodos de uso de estas y células derivadas de estas.

Un método para obtener una población de células madre adultas multipotentes de mamíferos que no soncélulas germinales ni embrionarias y que pueden ser inducidas a diferenciarse en al menos un tipo celulardiferenciado de cada una de las estirpes embrionarias mesodérmicas,

ectodérmicas y endodérmicas, donde lascélulas expresan oct4 y telomerasa, y donde el método comprende:

a) proporcionar una muestra de sangre del cordón umbilical o de la placenta

b) establecer una población de células adherentes

c) eliminar la población de células CD45+ presentes en las células;

d) recuperar las células CD45- y cultivar las células CD45- en un medio de cultivo que comprende FCE yFCDP;

e) seleccionar las células que expresan oct4 y telomerasa;

f) cultivar las células para formar una población y

g) aislar la población de células madre adultas multipotentes de mamíferos.

Células madre adultas multipotentes, fuentes de estas, métodos para obtenerlas y mantenerlas, métodos de 5 diferenciación de estas, métodos de uso de estas y células derivadas de estas

Campo de la invención La presente invención se refiere generalmente a células madre adultas multipotentes de mamíferos (CMAM) y más específicamente a métodos para obtener, mantener y diferenciar las CMAM. También se proporcionan usos de CMAM en el tratamiento terapéutico de la enfermedad.

Antecedentes de la invención La generación de un órgano y un tejido a partir de células madre, y su posterior trasplante proporcionan tratamientos prometedores para diferentes patologías, lo que convierte a las células madre en un punto central de investigación en muchos campos. La tecnología de las células madre proporciona una terapia alternativa prometedora para la diabetes, enfermedad de Parkinson, enfermedad hepática, enfermedad cardíaca y trastornos autoinmunitarios, por nombrar unos pocos. Sin embargo, hay al menos dos grandes problemas asociados con el trasplante de órganos y tejidos.

En primer lugar, hay escasez de donantes de órganos y tejidos. Tan solo un 5 por ciento de los órganos que se necesitan para trasplantes en los Estados Unidos llega alguna vez a estar disponible para el receptor (Evans et al. 1992) . De acuerdo con la Asociación Americana del Corazón, únicamente 2300 de los 40 000 americanos que necesitaron un corazón nuevo en 1997 recibieron uno. La Fundación Americana del Hígado declara que hay menos de 3000 donantes para los cerca de 30 000 pacientes que fallecen cada año debido a la insuficiencia hepática.

El segundo gran problema reside en la potencial incompatibilidad del tejido trasplantado con el sistema inmunitario del receptor. Debido a que el sistema inmunitario del receptor reconoce como extraño el órgano o tejido donado es necesario proporcionar al paciente medicamentos inmunosupresores con un coste significativo tanto económico como físico.

El xenotrasplante, o el trasplante de órganos o tejidos de otras especies, podrían proporcionar un medio alternativo para superar la escasez de órganos y tejidos humanos. El xenotrasplante ofrecería la ventaja de una planificación 35 avanzada. El órgano se podría extraer cuando todavía está sano y el paciente podría someterse a cualquier tratamiento previo beneficioso antes de la intervención quirúrgica para el trasplante. Desgraciadamente, el xenotrasplante no soluciona el problema de la incompatibilidad tisular, sino que lo exacerba. Además, de acuerdo con los Centros para el Control de Enfermedades, se dispone de evidencia de que los virus dañinos cruzan las barreras entre especies. Los cerdos se han convertido en candidatos probables como donantes de órganos y tejidos, sin embargo, se ha documentado la transmisión entre especies de más de un virus de cerdos a humanos. Por ejemplo, más de un millón de cerdos fueron sacrificados recientemente en Malasia en un esfuerzo por contener un brote del virus Hendra, una enfermedad que fue transmitida a más de 70 humanos con resultados mortales (Butler,

D. 1999) .

Células madre: Definición y uso La fuente más prometedora de órganos y tejidos para trasplantes, por tanto, reside en el desarrollo de la tecnología de las células madre. En teoría, las células madre pueden llevar a cabo una división celular autorrenovadora para dar lugar a células hija idénticas genotípica y fenotípicamente durante un tiempo indefinido y, finalmente, pueden diferenciarse en al menos un tipo celular final. Mediante la generación de órganos o tejidos a partir de las propias células madre del paciente, o mediante la alteración genética de células heterólogas de modo que el sistema inmunitario del receptor no las reconozca como extrañas, se pueden generar tejidos para trasplantes para proporcionar las ventajas asociadas con el xenotrasplante sin los riesgos asociados de infección o rechazo del tejido.

Las células madre también proporcionan la promesa de una mejora en los resultados de la terapia génica. Las propias células madre del paciente se podrían alterar in vitro y a continuación introducirlas de nuevo in vivo para producir el producto génico deseado. Estas células madre alteradas genéticamente tendrían el potencial de ser inducidas a diferenciarse para formar una multitud de tipos celulares para su implante en sitios específicos del cuerpo o para una aplicación sistémica. De manera alternativa, las células madre heterólogas podrían alterarse genéticamente para expresar los antígenos del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) del receptor, o ningún antígeno del MHC, lo que permitiría el trasplante de células de un donante a un receptor sin el riesgo asociado de rechazo.

Se define a las células madre como células que poseen el potencial de una proliferación amplia, se diferencian en varias estirpes celulares y repueblan los tejidos tras el trasplante. La célula madre por excelencia es la célula madre embrionaria (ME) ya que posee un potencial de diferenciación multipotente y autorrenovador ilimitado (Thomson, J. et al. 1995; Thomson, J.A. et al. 1998; Shamblott, M et al. 1998; Williams, R.L. et al. 1998; Orkin, S. 1998; Reubinoff,

B.E. et al. 2000) . Estas células se derivan de la masa celular interna del blastocisto (Thomson, J et al. 1995; Thomson, J.A. et al. 1998; Martin, G.R. 1981) o se pueden derivar de las células germinales primordiales a partir de un embrión tras la implantación (células germinales embrionarias o células GE) . Se han derivado células ME y GE de ratón y más recientemente también de primates no humanos y humanos. Cuando se introducen en los blastocistos de ratón, las células ME pueden contribuir a todos los tejidos del ratón (animal) (Orkin, S. 1998) . Las células ME murinas son por tanto pluripotentes. Cuando se trasplantan en animales que ya han nacido, las células ME y GE pueden generar teratomas, lo cual demuestra de nuevo su multipotencia. Las células ME (y GE) se pueden identificar por la tinción positiva con anticuerpos que detectan los antígenos embrionarios 1 y 4 específicos de la etapa (SSEA, por sus siglas en inglés) .

A nivel molecular, las células ME y GE expresan varios factores de transcripción muy específicos para estas células indiferenciadas. Estos incluyen oct-4 y Rex-1 y el receptor del factor inhibidor de la leucemia (R-FIL) . Los factores de transcripción sox-2 y Rox-1 se expresan tanto en las células ME como en las células no ME. Oct-4 se expresa en el embrión antes de la gastrulación, en el embrión en la etapa de segmentación temprana, en las células de la masa celular interna del blastocisto y en las células de carcinoma embrionario (CE) . En el animal adulto, oct-4 únicamente se encuentra en las células germinales.

Oct-4, en combinación con Rox-1, provoca la activación transcripcional de la proteína con dedo de zinc Rex-1 y también se necesita para mantener las células ME en un estado indiferenciado. El gen oct-4 experimenta una disminución regulada cuando se induce la diferenciación in vitro de las células. Varios estudios han mostrado que se necesita oct-4 para el mantenimiento del fenotipo indiferenciado de las células ME y que desempeña un papel principal en la determinación de las primeras etapas de la embriogénesis y diferenciación. Se necesita sox-2 junto con oct-4 para mantener el estado indiferenciado de las células ME/CE y para mantener las células ME murinas pero no las humanas. Las células germinales primordiales murinas o humanas requieren la presencia de FIL. Otra característica distintiva de las células ME es la presencia de niveles elevados de telomerasa, la cual proporciona a estas células un potencial ilimitado de autorrenovación in vitro.

Se han identificado células madre en la mayor parte de los órganos o tejidos. La mejor caracterizada es la célula madre hematopoyética (CMH) . Esta célula derivada del mesodermo se ha purificado basándose en los marcadores de la superficie celular y en características funcionales. La CMH, aislada a partir de la médula ósea (MO) , sangre, sangre del cordón umbilical, hígado fetal y saco vitelino, es la célula progenitora que genera los glóbulos sanguíneos o tras la traducción inicia de nuevo varias estirpes hematopoyéticas y puede reiniciar hematopoyesis de por vida en el receptor. (Remítase a Fei, R., et al., patente de los EE. UU. N.º 5.635.387; McGlave, et al., patente de los EE. UU. N.º 5.460.964; Simmons, P., et al., patente de los EE. UU. N.º 5.677.136; Tsukamoto, et al., patente de los EE. UU. N.º 5.750.397; Schwartz, et al., patente de los EE. UU. N.º , 759, 793; DiGuisto, et al., patente de los EE. UU. N.º 5.681.599;... [Seguir leyendo]

1. Un método para obtener una población de células madre adultas multipotentes de mamíferos que no son células germinales ni embrionarias y que pueden ser inducidas a diferenciarse en al menos un tipo celular

diferenciado de cada una de las estirpes embrionarias mesodérmicas, ectodérmicas y endodérmicas, donde las células expresan oct4 y telomerasa, y donde el método comprende:

a) proporcionar una muestra de sangre del cordón umbilical o de la placenta b) establecer una población de células adherentes 10 c) eliminar la población de células CD45+ presentes en las células; d) recuperar las células CD45-y cultivar las células CD45- en un medio de cultivo que comprende FCE y

FCDP; e) seleccionar las células que expresan oct4 y telomerasa; f) cultivar las células para formar una población y

g) aislar la población de células madre adultas multipotentes de mamíferos.

2. El método de cual quiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende cultivar las células en presencia de un factor de diferenciación y de este modo generar una célula diferenciada.

3. El método de la reivindicación 2, donde el factor de diferenciación se selecciona del grupo constituido por factor de crecimiento de fibroblastos básico (FCFb) ; factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV) ; sulfóxido de dimetilo (DMSO) e isoproterenol; y factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FCF4) y factor de crecimiento de hepatocitos (FCH) .

4. El método de la reivindicación 1, que comprende el paso adicional de producir un medicamento para uso en el injerto de células multipotentes en un tejido.

5. El método de cualquier reivindicación precedente, que además comprende producir un medicamento farmacéutico que comprende mezclar las células y un portador farmacéuticamente aceptable. 30

6. El método de cualquier reivindicación precedente, donde la célula posee la capacidad de ser inducida a diferenciarse para formar células seleccionadas del grupo constituido por tipos celulares oligodendrocíticos, neuronales, neurogliales, hematopoyéticos, pancreáticos, hepáticos, epiteliales, endoteliales, oculares, de músculo cardíaco, músculo liso, músculo esquelético, estroma medular, fibroblastos, adipocitos, condrocitos y osteoblastos.

7. El método de cualquier reivindicación precedente, donde las células no forman teratomas cuando se administran a un paciente.