Células derivadas de riñon y metodo de uso en la reparación y regeneración tisular.

Una población de células aisladas o purificadas derivadas del riñón humano,

dicha población de célulascapaces de auto-renovación y expansión en cultivo, en el que la población de células es positiva para la expresiónde marcadores de superficie celular HLA I y CD44 y al menos una de Oct-4, Red-1, Pax-2, Cadherina-11, FoxD1,WT1, Eyal, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, o GDF5 y negativas para la expresión de marcadores desuperficie celular CD133, E-cadherina, y Wnt-4 y al menos una de Sox2, FGF4, hTert, SIX2 o GATA-4

REMISIÓN RELATIVA A LA APLICACIÓN

Esta aplicación cuenta con el beneficio de los artículos Nro. 60/829, 238 de la Aplicación Provisional de Estados Unidos archivados el 12 de octubre de 2006.

ESPECIALIDAD

El invento, en términos generales, se aplica a las poblaciones de células aisladas o purificadas derivadas de riñón humano, provenientes de tejido de riñón de mamífero. El invento, asimismo, se relaciona con los métodos para el aislamiento y la purificación de la población de células derivadas de riñón humano. También se provee la población de células del invento para su uso en un método para el tratamiento de la enfermedad del riñón.

ANTECEDENTES

Los daños nefrotóxicos e isquémicos al riñón llevan a la insuficiencia renal aguda y muy frecuentemente se manifiestan como una necrosis tubular aguda. La recuperación de la función renal luego de una insuficiencia renal aguda depende del reemplazo de las células tubulares necróticas por epitelio tubular funcional. Además, luego de daño isquémico, se observa una pronunciada respuesta proliferativa del endotelio capilar glomerular y peritubular. La ausencia o reducción de regeneración epitelial y endotelial puede predisponer a un paciente a la cicatrización renal túbulointersticial y la enfermedad renal crónica. Primariamente, el origen de las nuevas células renales generadas es indefinido, pero por analogía con otros órganos, se ha sugerido que las células pluripotentes órgano-específicas (es decir, células madre renales) son precursoras de células nuevas. Sin embargo, falta identificar las células progenitoras renales adultas. Bussolati y otros, Consejo Americano de Patología, 166: 545-555, 2005.

La evidencia no es conclusiva para demostrar el aislamiento y cultivo las células progenitoras renales. Sin embargo, algunos laboratorios han hecho algunos intentos de identificar y aislar dichas células. Por ejemplo, un estudio en roedores mostró que la papila renal es un nicho para células madre de riñón adulto. Otros experimentos demostraron que las células papilares renales aisladas poseen algún grado de diferenciación multipotencial y cuando son inyectadas directamente en la corteza renal, se injertan en el parénquima del riñón. Estos resultados sugieren que la papila renal es un nicho para una población de células progenitoras renales implicadas en el mantenimiento y la reparación del riñón. Sin embargo, debe aun determinarse la existencia de este nicho progenitor en los riñones humanos. Oliver y otros, J. of Clinical Investigation, 114: 795-804, 2004. Solicitud de Patente Internacional PCT No. W02005/021738.

Se ha aislado células progenitoras humanas putativas de tejido renal de riñón cadavérico. El aislamiento de estas células se basó en una separación de células con bolas magnéticas dirigidas al marcador de superficie CD133. Otros experimentos mostraron que las células CD133+ derivadas del riñón tienen la capacidad de expandirse en el cultivo y diferenciarse in vitro en células epiteliales o endoteliales. Al implantarse en ratones SCID, las células CD133+ formaron estructuras tubulares que expresaban marcadores epiteliales renales. Además, la inyección intravenosa en ratones con tubulonecrosis inducida por glicerol, las células CD133+ migraron y se integraron al tejido renal dañado. Bussolati y otros, Consejo Americano de Patología, 166: 545-555, 2005. Estos datos indican que existen presentes células progenitoras en el tejido del riñón humano y es posible que jueguen un rol en la reparación renal. Sin embargo, la población residente de células CD133+ en el tejido del riñón humano es muy baja y por tanto poco práctica para la terapia celular con base alogénica. Un método reciente para identificar células madre órgano–específicas utilizó métodos de aislamiento basados en la habilidad de las células progenitoras para producir el flujo de salida del colorante Hoechst 33342. Las células que demuestran esta habilidad han sido denominadas células SP y han mostrado diversos grados de características de células madre. Los estudios han mostrado que el intersticio renal de los riñones de roedores contiene células SP. Además, se inyectó células SP de riñón en ratones con insuficiencia renal aguda. Hishikawa y otros, J. of Cell Biology, 169: 921-928, 2005. Aparentemente estas células migraron al espacio intersticial y jugaron un rol en la reparación del tejido renal dañado. Sin embargo, falta determinar la existencia de células SP en el tejido de riñón humano. Existe la necesidad de mejorar la fuente de células derivadas de riñón humano o de mamífero para su uso en terapia celular, que puedan ser aisladas de tejido de riñón humano o de mamífero y desarrollado en un cultivo celular.

RESUMEN

Este invento provee una población de células aisladas o purificadas derivadas de riñón humano de tejido de riñón humano. Se proveen métodos para el aislamiento y purificación de la población de células derivadas de riñón humano. Una población particular de células derivadas de riñón humano tiene determinadas características fenotípicas, por ejemplo la morfología, el potencial de crecimiento, el fenotipo de marcador de superficie, la expresión temprana de genes y la expresión de genes de desarrollo del riñón. Tanto el fenotipo de marcador de superficie como el de expresión de genes se conservan luego de los múltiples pasajes de la población de células derivadas de riñón humano en un cultivo.

En un aspecto de la invención se provee una población de células aisladas o purificadas derivadas del riñón humano, siendo que dicha población de células capaz de auto-renovación y expansión en el cultivo, en el que la población de células es positiva para la expresión de marcadores de superficie celular HLAI y CD44 y al menos uno de Oct-4, Rex-1, Pax-2, Cadherin-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17 EpoR, BMP2, BMP7, o GDF5 y negativa para la expresión de marcadores de superficie celular CDI33, E-codherin, y Wnt-4 y al menos uno de Sox2, FGF4, hTert, SIX2 o GATA-4.

Otro aspecto de la población de células aisladas o purificadas derivadas de riñón humano, es que es positiva para al menos uno de los marcadores de superficie celular CD24, CD29, CD49c, CD73, CD166, o SSEA-4, negativa para al menos uno de los marcadores de superficie celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD138, o CD141. La población de células preferentemente es no inmunogénica para transplante alogénico en un sujeto humano. La población de células derivadas de riñón humano puede secretar al menos uno de los factores tróficos FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 o VEGF. Preferiblemente la población de células no secreta al menos uno de los factores tróficos PDGF-bb o IL12p70.

La población de células derivadas de riñón humano pueden derivar de la región subcapsular del riñón, de la corteza o de la médula del riñón. La población de células derivadas de riñón humano puede incluir células progenitoras renales.

La población de células del invento puede usarse para tratar enfermedad isquémica del riñón en un sujeto humano donde el tratamiento implica administrar al sujeto humano una cantidad terapéuticamente efectiva de población de células aisladas o purificadas derivadas de riñón humano, tal como se describe más arriba, por ende reduciendo o eliminando la enfermedad isquémica del riñón en el sujeto humano.

También se provee la población de células del invento para su uso en un método de reemplazo de tejidos, órganos, componentes o estructuras renales que estén dañados debido a un trauma, la edad, una herida metabólica o tóxica, enfermedad o pérdida idiopática en un sujeto humano. El método comprende la administración a un sujeto humano de una cantidad terapéuticamente efectiva de una población de células aisladas o purificadas derivadas de riñón humano, por ende reduciendo o eliminando los tejidos u órganos dañados, y restaurando la función del riñón en el sujeto humano.

Otro aspecto del invento se relaciona con el método para aislar o enriquecer selectivamente la población de células derivadas de riñón humano. Este método consiste en obtener tejido de la región subcapsular, la corteza o la médula del riñón humano, incubar el tejido en presencia de una metaloproteasa, una proteasa neutra o una enzima mucolítica, sembrar las células en un recipiente de cultivo de tejido, identificar la población de células que es positiva para la expresión de los marcadores de superficie celular HLAI CD44 y al menos uno de Oct4, Rex-1, Pax-2, Cadherina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, o GDF5 y negativo... [Seguir leyendo]

1. Una población de células aisladas o purificadas derivadas del riñón humano, dicha población de células capaces de auto-renovación y expansión en cultivo, en el que la población de células es positiva para la expresión de marcadores de superficie celular HLA I y CD44 y al menos una de Oct-4, Red-1, Pax-2, Cadherina-11, FoxD1, WT1, Eyal, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, o GDF5 y negativas para la expresión de marcadores de superficie celular CD133, E-cadherina, y Wnt-4 y al menos una de Sox2, FGF4, hTert, SIX2 o GATA-4.

2. La población de células de la reclamación 1 que es positiva para al menos uno de los marcadores de la suerficie celular CD24, CD29, CD49c, CD73, CD 166, o SSEA-4, y negativa para al menos uno de los marcadores de la superficie celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD138, o CD141.

3. La población de células de la reclamación 1, en el que las células se derivan de la corteza renal, médula renal o región renal subcapsular.

4. La población de células de la reivindicación 1, aquí la población de células secreta al menos uno de los factores tróficos FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 o VEGF y no secreta al menos uno de los factores tróficos PDGF-bb o IL12p70.

5. Un método para la preparación de una población aislada de células de riñón humano derivada que comprende, incubar el tejido obtenido a partir de una región subcapsular, una corteza o una médula de un riñón humano en la presencia de uno o más metaloproteasas, proteasa neutra, o enzima mucolítica para disociar al menos una parte del tejido en células individuales en placas de las células en un sustrato, identificando dentro de dichas células un subconjunto de las células que es positivo para la expresión de marcadores de superficie celular HLA I y CD44 y al menos uno de Oct-4, Rex-1, Pax-2, Cadherina-11, FoxD1, WT1, Eyal, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, o GDF5 y negativo para la expresión de marcadores de superficie celular CD133, E-cadherina, and Wnt-4 y al menos uno de Sox2, FGF4, hTert, SIX2 o GATA-4, y aislar ese subconjunto de células para proporcionar dicha población celular derivada de riñón humano.

6. Un método para la detección de un candidato a medicamento para el tratamiento de un trastorno que involucra células renales en un sujeto humano que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una población celular derivada de riñón humano aislada o purificada obtenida de una región subcapsular, una corteza o una médula de un riñón humano, dicha población capaz de autorenovación y expansión en cultivo, en el que la población de células es positiva para la expresión de marcadores la superficie celular HLA I y CD44 y al menos una de Oct-4, Red-1, Pax-2, Cadherina-11, FoxD1, WT1, Eyal, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, o GDF5 y negativos para la expresión de marcadores de superficie celular CD133, E-cadherina, y Wnt-4 y al menos una de Sox2, FGF4, hTert, SIX2 o GATA-4;

(b) cultivo de la población de células de riñón humano derivada de las condiciones de proliferación para obtener una composición celular que comprende células con potencial o aumento potencial de autorenovación y expansión in vitro;

(c) exponer las células cultivadas obtenidas a partir de la etapa (a) o (b) al candidato a medicamento; y

(d) detectar la presencia o ausencia de un efecto del candidato a medicación sobre la supervivencia de las células o una característica morfológica, funcional, o fisiológica y / o propiedad biológica molecular de dichas células, en donde una alteración en la supervivencia celular, una característica fisiológica, morfológica o funcional de las células, y / o una propiedad biológica molecular de las células indica una actividad del candidato a medicación para tratar el trastorno de células renales.

7. Un método para ensayar la toxicidad de una sustancia de prueba para afectar la función celular de riñón que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una población celular derivada de riñón humano aislada o purificada obtenida de una región subcapsular, una corteza o una médula de un riñón humano, en el que la población de células es capaz de auto-renovación y expansión en cultivo, es positiva para la expresión de marcadores de superficie celular HLA I y CD44 y al menos uno de Oct-4, Rex-1, Pax-2, cadherina-11, FoxD1, WT1, Eyal, HNF3B, CXC-R4, SOX-17, EpoR, BMP2, BMP7, o GDF5 y negativos para la expresión de marcadores de superficie celular CD133, e-cadherina, y Wnt-4 y al menos uno de Sox2, FGF4, hTERT, SIX2 o GATA-4;

(b) la exposición de la población de células a la sustancia de prueba; y

(c) detectar la presencia o ausencia de efecto de la sustancia de ensayo sobre la supervivencia de las células en la población o en una característica morfológica, funcional, o fisiológica y / o propiedad biológica molecular de las células en la población, por lo que el efecto de alterar la supervivencia celular, una característica morfológica, funcional, o fisiológica de las células y / o una propiedad biológica molecular de las células en la población indica la toxicidad de la sustancia de prueba a la función de las células del riñón.

8. Las células genéticamente alteradas para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad en un

sujeto humano con terapia de genes están caracterizadas porque se preparan a través de:

proporcionar una población aislada o purificada de células derivadas de riñón humano obtenida de una región subcapsular, una corteza o una médula de un riñón humano, en el que la población de células es capaz de auto-renovación y expansión en cultivo, positivo para la expresión de marcadores de superficie celular HLA I y CD44 y al menos uno de Oct-4, Rex-1, Pax-2, cadherina-11, FoxD1, WT1, Eyal, HNF3B, CXC-R4, Medias-17, EpoR, BMP2, BMP7, o GDF5 y negativo para la expresión de marcadores de superficie celular CD133, e-cadherina, y Wnt-4 y al menos uno de Sox2, FGF4, hTERT, SIX2 o GATA-4 alterar genéticamente al menos una célula de la población celular derivada de riñón humano aislada o purificada para producir un producto génico terapéutico, expandiendo las células genéticamente modificadas en cultivo.

9. La población de células de la reclamación 1 que es negativa para al menos uno de los marcadores de la superficie celular HLA II, CD80, o CD86.

10. Células alteradas genéticamente para uso en un método de tratamiento de una enfermedad de acuerdo con la reclamación 8, en el que la población de células es negativa para al menos uno de los marcadores de la superficie celular HLA II, CD80, o CD86.

11. La población de células no-inmunogénicas de la reclamación 9 para su uso en el tratamiento de un sujeto humano mediante trasplante alogénico.

12. Células genéticamente alteradas para uso en un método para tratar una enfermedad de acuerdo con la reclamación 10 mediante trasplante alogénico.

13. 13. La población de células de acuerdo con cualquiera de las reclamaciones 1-4 para uso en la reducción o eliminación de la enfermedad del tejido isquémico del riñón o para la sustitución de los tejidos renales, órganos, componentes o estructuras que estén dañados debido a un trauma, la edad, lesión metabólica o tóxica, enfermedad

o pérdida idiopática en un sujeto humano.

14. Las células alteradas genéticamente para su uso en un tratamiento de una enfermedad de acuerdo con la reclamación 10 o la reclamación 12, en el que el tratamiento consiste en la reducción o eliminación de la enfermedad del tejido isquémico del riñón o para la sustitución de los tejidos renales, órganos, componentes o estructuras que son dañadas debido a un traumatismo, edad, lesión metabólica o tóxica, enfermedad o la pérdida idiopática en un sujeto humano.

15. La población de células de acuerdo con cualquiera de las reclamaciones 1-4 para uso de acuerdo con la reclamación 13, en el que un efecto seleccionado de: (a) formación de los vasos sanguíneos que suministran sangre al tejido isquémico; (b) flujo de sangre al tejido isquémico; (c) suministro de oxígeno al tejido isquémico, y (d) combinaciones de los mismos se inducen.

16. Las células alteradas genéticamente para su uso acuerdo con la reclamación 14, en el que un efecto seleccionado de: (a) formación de los vasos sanguíneos que suministran sangre al tejido isquémico; (b) flujo de sangre al tejido isquémico; (c) suministro de oxígeno al tejido isquémico, y (d) combinaciones de los mismos se inducen.

17. La población de células de acuerdo con cualquiera de las reclamaciones 1-4 para su uso acuerdo con la reclamación 13, en el que el tratamiento consiste en la inducción de la formación de tejido de la región subcapsular renal, tejido de la corteza renal, o tejido de médula renal.

18. Las células alteradas genéticamente para su uso acuerdo con la reclamación 14, en el que se induce la formación de tejido de la región subcapsular renal, tejido de corteza renal, o tejido de médula renal.

19. El método de la reclamación 5, que comprende además el aislamiento de una célula única derivada de riñón humano por dilución limitante y la ampliación de la célula en cultivo celular.

20. Las células alteradas genéticamente para su uso de acuerdo con la reclamación 8, en la que la enfermedad se selecciona entre enfermedad renal, lesión renal, isquemia renal, o un defecto genético en el sujeto humano.

21. Las células genéticamente alteradas para su uso en el tratamiento de una enfermedad de acuerdo con la reclamación 8, caracterizada porque las células se trasplantan en el útero para producir células de riñón humano en el sujeto humano prenatal o postnatal después del trasplante, en el que las células producen productos terapéuticos para reducir o eliminar la enfermedad en el sujeto humano.

22. El método de la reclamación 6 o 7, en el que la característica morfológica, funcional, o fisiológica de la célula aumenta la formación de túbulos renales o de expresión de BMP o receptor de BMP.

23. El método de la reclamación 6 o 7, en el que la característica morfológica, funcional, o fisiológica de las células aumenta la secreción de al menos uno o más de los factores tróficos FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1, TIMP-2, VEGF, o MMP -2.

24. El método de la reclamación 6, en el que el trastorno es la enfermedad renal isquémica o daño a los tejidos del riñón, órganos, componentes o estructuras debido a un trauma, edad, lesión metabólica o tóxica, enfermedad o pérdida idiopática en un sujeto humano.

25. El método de la reclamación 7, en el que la mayor toxicidad de la sustancia de prueba se mide como disminución de la formación de túbulos renales o disminución de la expresión de la BMP o receptor de BMP.