Cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos para estudios de clonalidad basados en PCR de transposiciones en BCL2-IGH.

Un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar una translocación cromosómica t(14;

18) en BCL2-IGH, que comprende al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona de los cebadores para MBR, los cebadores para 3'MBR y los cebadores para mcr mostrados en la Fig. 11A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador de consenso para JH mostrado en la Fig. 11A.

Cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos para estudios de clonalidad basados en PCR de transposiciones en BCL2-IGH

La presente invención se refiere a estudios de clonalidad basados en PCR para entre otros el diagnóstico precoz de trastornos linfoproliferantes. En la mayoría de los pacientes en los que se sospecha la presencia de trastornos linfoproliferantes, la histomorfología o citomorfología complementada con inmunohistología o inmunofenotipado citométrico de flujo puede discriminar entre linfoproliferaciones malignas y reactivas. Sin embargo, en el 5 a 10% de los casos, realizar el diagnóstico es más complicado. El diagnóstico de neoplasias malignas linfoides se puede apoyar en la determinación de la clonalidad basada en el hecho de que en principio todas las células de una neoplasia maligna tienen un origen clonal común.

La mayoría de las neoplasias malignas linfoides pertenece al linaje de linfocitos B (90 a 95%) y sólo una minoría pertenece al linaje de linfocitos T (5-7%) o al linaje de linfocitos asesinos naturales (abreviadamente NK por la expresión inglesa "natural killer") (<2%) . Las leucemias linfoblásticas agudas (abreviadamente ALL por la expresión inglesa “acute lymphoblastic leukemia”) se originan en linfocitos T en el 15 a 20% de los casos, pero en el grupo de leucemias linfoides maduras y en los linfomas no Hodgkin (abreviadamente NHL por la expresión inglesa “non-Hodgkin lymphoma”) las neoplasias malignas de linfocitos T son relativamente poco frecuentes, excepto en subgrupos específicos, tales como linfomas cutáneos (Tabla 1) . En consecuencia, la gran mayoría de las neoplasias malignas linfoides (>98%) contiene genes de inmunoglobulina (Ig) idénticamente (clonalmente) transpuestos y/o del receptor de linfocitos T (abreviadamente TCR por la expresión inglesa “T-cell receptor”) y en el 25 a 30% de los casos también se encuentran anomalías cromosómicas bien definidas, los cuales pueden servir como marcadores para la clonalidad1, 2 .

Los locus de los genes Ig y TCR contienen muchos y diferentes segmentos génicos variables (V) , de diversidad (D) y de unión (J) , que están sometidos a procesos de transposición durante la diferenciación linfoide temprana3, 4. Las transposiciones de V-D-J son mediadas por un complejo de enzimas recombinasas en el que las proteínas RAG1 y RAG2 desempeñan un papel clave reconociendo y cortando el DNA en las secuencias de señal de recombinación (abreviadamente RSS por la expresión inglesa “recombination signal sequences”) , que están situadas aguas abajo de los segmentos génicos V, a ambos lados de los segmentos génicos D y aguas arriba de los segmentos génicos J (Figura 1) . Unas RSS inadecuadas reducen o incluso evitan completamente la transposición.

El proceso de transposición comienza generalmente con una transposición de D a J seguida de una transposición de V a D-J en caso de genes de una cadena pesada de Ig (abreviadamente IGH por la expresión inglesa “Ig heavy”) , de TCR beta (TCRB) y de TCR delta (TCRD) (Figura 1) o se refiere a transposiciones directas de V a J en caso de genes de Ig kappa (IGK) , de Ig lambda (IGL) , de TCR alfa (TCRA) y de TCR gamma (TCRG) . Las secuencias entre los segmentos génicos transpuestos se eliminan generalmente en forma de un producto de escisión circular, denominado también círculo de escisión del TCR (abreviadamente TREC por la expresión inglesa “TCR excision circle”) o círculo de escisión del receptor de linfocitos B (abreviadamente BREC por la expresión inglesa “B cell receptor excision circle”) (Figura 1) .

Las transposiciones de los genes Ig y TCR durante la diferenciación linfoide temprana siguen generalmente un orden jerárquico. Durante la diferenciación de linfocitos B: en primer lugar se transponen los genes IGH, a continuación IGK, dando potencialmente como resultado la expresión de IgH/κ o seguido por la deleción de IGK y transposición de IGL, seguido potencialmente por la expresión de IgH/λ5. Esto implica que virtualmente todos los linfocitos B con Igλ+ tengan deleciones monoalélicas o bialélicas de los genes IGK. Durante la diferenciación de los linfocitos T: en primer lugar se transponen los genes TCRD, a continuación TCRG, dando potencialmente como resultando la expresión de TCRγδ o seguido de otra transposición de TCRB y deleción de TCRD con subsiguiente transposición de TCRA, seguido potencialmente por la expresión de TCRαβ. Los patrones de transposición de los genes Ig y TCR en neoplasias malignas linfoides se ajustan en general al orden jerárquico descrito anteriormente, aunque también se encuentran patrones de transposición inusuales, particularmente en la ALL6.

Las muchas combinaciones diferentes de los segmentos génicos V, D y J representan la llamada variedad combinatoria (Tabla 2) , que se estima en ~2x106 para las moléculas de Ig, ~3x106 para las moléculas de TCRαβ y ~5x103 para las moléculas de TCRγδ. En los sitios de unión de los segmentos génicos V, D y J tienen lugar la deleción e inserción aleatoria de nucleótidos durante el proceso de transposición, dando como resultado regiones de unión muy diversas, que contribuyen significativamente a la variedad total de moléculas de Ig y de TCR, que se estima >1012.5

Los linfocitos B maduros amplían más su variedad de Ig por el reconocimiento de antígenos en los centros foliculares por medio de la hipermutación somática, un proceso que conduce a la maduración por afinidad de las moléculas de Ig. El proceso de hipermutación somática se centra en el exón V- (D-) J de los genes IGH y de la cadena ligera de Ig y afecta a las mutaciones de un solo nucleótido y algunas veces también a las inserciones o deleciones de nucleótidos. Los genes Ig mutados somáticamente se encuentran también en las neoplasias malignas de linfocitos B maduros de origen folicular o post-folicular7.

Los genes Ig y TCR transpuestos funcionalmente dan como resultado la expresión en la membrana de superficie de las moléculas de Ig, TCRαβ o TCRγδ. Basándose en el concepto de que sólo un único tipo de moléculas de Ig o de TCR es expresado por un linfocito o un clon de linfocitos, los genes clonalmente transpuestos de neoplasias malignas linfoides maduras podrían ser detectables a nivel de las proteínas. Durante largo tiempo se ha utilizado la detección de la expresión de una sola cadena ligera de Ig (Igκ o Igλ) para discriminar entre linfocitos B (policlonales) reactivos (relación normal Igκ/Igλ: 0, 7-2, 8) frente a linfocitos B (clonales) anómalos con relaciones Igκ/Igλ >4, 0 o <0, 58-10. En la gran mayoría (>90%) de neoplasias malignas de linfocitos B maduros, la expresión de una sola cadena ligera de Ig puede fundamentar el origen clonal de la neoplasia maligna.

También, el desarrollo de muchos anticuerpos diferentes contra dominios variables de las diversas cadenas de TCR

permite la detección de los dominios monotípicos Vβ, Vγ y Vδ, en comparación con valores de referencia apropiados11-16 . En la interpretación de los resultados de Vβ monotípicos utilizando 20 a 25 anticuerpos contra diferentes familias de Vβ (Tabla 2) , se debe apreciar que las expansiones de linfocitos T de TCRαβ+ clonales clínicamente benignas (frecuentemente CD8+) se encuentran regularmente en la sangre periférica (abreviadamente PB por la expresión inglesa “peripheral blood”) de los individuos de más edad13, 17. Estas expansiones de linfocitos T clonales en la PB tienen sin embargo un tamaño relativamente pequeño: <40% de linfocitos T de PB y <0, 5x106/mL de PB13. Todavía no está claro hasta qué punto dichos clones de linfocitos T clínicamente benignos pueden también encontrarse en los tejidos linfoides.

Los resultados de la expresión de los dominios monotípicos Vγ y Vδ se deben interpretar con cautela, ya que en individuos sanos se ha seleccionado una fracción grande de linfocitos T de TCRγδ+ policlonales normales para el uso de Vγ9-Jγ1.2 y Vδ2-Jδ118, 19. En consecuencia, las altas frecuencias de linfocitos T de Vγ9+/Vδ2+ en la PB deben considerarse como un hallazgo normal, salvo que los recuentos absolutos sean 1 a 2x106/mL de PB. Se debe señalar que la mayoría de neoplasias malignas de linfocitos T de TCRγδ+ expresan el segmento génico Vδ1 u otro segmento no Vδ2 en combinación con un único dominio Vγ (generalmente no Vγ9) 15, 20 .

La detección de la expresión restringida de Igκ o Igλ... [Seguir leyendo]

1. Un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar una translocación cromosómica t (14;18) en BCL2-IGH, que comprende al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona de los cebadores para MBR, los cebadores para 3'MBR y los cebadores para mcr mostrados en la Fig. 11A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador de consenso para JH mostrado en la Fig. 11A.

2. El conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde uno o más de los cebadores directos se seleccionan de los cebadores para MBR mostrados en la Fig. 11A.

3. El conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde uno o más de los cebadores directos se seleccionan de los cebadores para 3'MBR mostrados en la Fig. 11A.

4. El conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde uno o más de los cebadores directos se seleccionan de los cebadores para mcr mostrados en la Fig. 11A.

5. Un ensayo de amplificación de ácidos nucleicos, preferiblemente un ensayo de PCR, más preferiblemente un ensayo de PCR múltiple, que usa al menos un conjunto de cebadores de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3 o 4.

6. El ensayo de amplificación de ácidos nucleicos de la reivindicación 5, caracterizado porque es un ensayo de PCR.

7. El ensayo de amplificación de ácidos nucleicos de la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque es un ensayo de PCR múltiple, que comprende además uno o más de los conjuntos de cebadores elegidos del grupo que consiste en:

a. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar una transposición VH-JH en IGH, que comprende al menos un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona de cebadores de la familia VH mostrada en la Fig. 3B, y en donde dicho cebador inverso es el cebador de consenso para JH mostrado en la Fig. 3B.

b. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar una transposición DH-JH en IGH, que comprende al menos un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona los cebadores de la familia DH mostrada en la Fig. 4A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador de consenso para JH mostrado en la Fig. 4A.

c. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar una transposición Vκ-Jκ en IGK, que comprende al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona de cebadores de la familia Vκ mostrada en la Fig. 5B, y en donde dicho cebador inverso se selecciona de los cebadores para Jκ mostrados en la Fig. 5B.

d. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar una transposición Vκ/intrón-Kde en IGK, que comprende al menos un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona de los cebadores Vκ o el cebador INTR mostrado en la Fig. 5B, y en donde dicho cebador inverso es el cebador para Kde mostrado en la Fig. 5B.

e. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar una transposición Vλ-Jλ en IGL, que comprende al menos un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona de los cebadores Vλ mostrados en la Fig. 6B, y en donde dicho cebador inverso es el cebador para Jλ mostrado en la Fig. 6B.

f. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar una transposición Vβ-Jβ en TCRB, que comprende al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona de cebadores de la familia Vβ mostrados en la Fig. 7B y en donde dicho cebador inverso se selecciona de los cebadores para JβA y JβB mostrados en la Fig. 7B.

g. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar una transposición Dβ-Jβ en TCRB, que comprende al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona de cebadores de la familia Dβ mostrados en la Fig. 7B y en donde dicho cebador inverso se selecciona de los cebadores para JβA y JβB mostrados en la Fig. 7B.

h. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar una transposición Vγ-Jγ en TCRG, que comprende al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona de cebadores de la familia Vγ mostrados en la Fig. 8B, y en donde dicho cebador inverso se selecciona de los cebadores para Jγ mostrados en la Fig. 8B.

i. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar una transposición Vδ-Jδ en TCRD, que comprende al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona de los cebadores Vδ mostrados en la Fig. 9B, y en donde dicho cebador inverso se selecciona de los cebadores para Jδ mostrados en la Fig. 9B.

j. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar una transposición Dδ-Dδ en TCRD, que comprende un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador Dδ2 mostrado en la Fig. 9B, y en donde dicho cebador inverso es el cebador para Dδ3 mostrado en la Fig. 9B.

k. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar una transposición Dδ-Jδ enTCRD, que comprende un cebador directo y al menos un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador para Dδ2 mostrado en la Fig. 9B, y en donde dicho cebador inverso se selecciona de los cebadores para Jδ mostrados en la Fig. 9B.

l. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar una transposición Vδ-Dδ en TCRD, que comprende al menos un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona de los cebadores para Vδ mostrados en la Fig. 9B, y en donde dicho cebador inverso es el cebador para Dδ3 mostrado en la Fig. 9B.

m. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar una translocación cromosómica (11;14) (BCL1-IGH) , que comprende un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador para BCL1/MTC mostrado en la Fig. 10A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador de consenso para JH mostrado en la Fig. 10A.

n. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar el gen TBXAS1 humano, que comprende un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador TBXAS1/X9U de la Fig. 12A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador TBXAS1/X9L de la Fig. 12A.

o. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar el gen de la proteína activante de recombinación humana (RAG1) , que comprende un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador RAG1/X2U de la Fig. 12A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador RAG1/X2L de la Fig. 12A.

p. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar la proteína dedo de zinc de la leucemia promielocítica humana (PLZF) , que comprende un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador PLZF/X1U de la Fig. 12A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador PLZF/X1L de la Fig. 12A.

q. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar el gen AF4 humano (Exón 3) , que comprende un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador AF4/X3U de la Fig. 12A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador AF4/X3L de la Fig. 12A, y

r. un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos capaz de amplificar el gen AF4 humano (Exón 11) , que comprende un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador AF4/X11U de la Fig. 12A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador AF4/X11L de la Fig. 12A.

8. Un método para detectar una translocación cromosómica t (14;18) en BCL2-IGH, que comprende usar uno o más conjuntos de cebadores de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 en un ensayo de amplificación de ácidos nucleicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-7.

9. Un método para detectar dos o más transposiciones, dos o más translocaciones o al menos una transposición y al menos una translocación, seleccionadas del grupo que consiste en una transposición VH-JH en IGH, una transposición DH-JH en IGH, una transposición Vκ-Jκ en IGK, una transposición Vκ/intrón-Kde en IGK, una transposición Vλ-Jλ en IGL, una transposición Vβ-Jβ en TCRB, una transposición Dβ-Jβ en TCRB, una transposición Vγ-Jγ en TCRG, una transposición Vδ-Jδ en TCRD, una transposición Dδ-Dδ en TCRD, una transposición Dδ-Jδ en TCRD, una transposición Vδ-Dδ en TCRD, una translocación t (11;14) (BCL1-IGH) y una translocación t (14;18) (BCL2-IGH) , usando un ensayo de amplificación de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha transposición comprende al menos una translocación cromosómica t (14;18) en BCL2-IGH

10. Un método para determinar transposiciones clonales, que comprenden al menos una translocación cromosómica t (14;18) en BCL2-IGH usando al menos el conjunto de cebadores de acuerdo con la reivindicación y opcionalmente al menos un conjunto de cebadores como los definidos en la reivindicació.

7. 7m.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, para la detección de una enfermedad mínima residual (MRD) o para la identificación de dianas para PCR que se han de usar para la detección de MRD por una PCR cuantitativa en tiempo real.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde se detecta un ácido nucleico amplificado usando un análisis automático de fragmentos de PCR de alta resolución.

13. Un kit para la detección de al menos una translocación cromosómica t (14;18) en BCL2-IGH y opcionalmente una transposición seleccionada del grupo que consiste en: una transposición VH-JH en IGH, una transposición DH-JH en IGH, una transposición Vκ-Jκ en IGK, una transposición Vκ/intrón-Kde en IGK, una transposición Vλ-Jλ en IGL, una transposición Vβ-Jβ en TCRB, una transposición Dβ-Jβ en TCRB, una transposición Vγ-Jγ en TCRG, una transposición Vδ-Jδ en TCRD, una transposición Dδ-Dδ en TCRD, una transposición Dδ-Jδ en TCRD, una transposición Vδ-Dδ en TCRD, y una translocación t (11;14) (BCL1-IGH) , que comprende usar al menos el conjunto de cebadores de acuerdo con la reivindicación 1, y opcionalmente al menos un conjunto de cebadores como los definidos en la reivindicació.

7. 7m.

14. Un kit de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende además al menos un conjunto de cebadores como los definidos en la reivindicació.

7. 7r.

15. Uso de un método de acuerdo con la reivindicación 11, para determinar la calidad de una muestra de DNA

extraída de una muestra biológica, preferiblemente una muestra biológica embebida en parafina.

16. El conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además cebadores directos que comprenden los cebadores Vβ, Dβ1, Dβ2 mostrados en la Fig. 7B, los cebadores de la familia VH mostrados en la Fig. 3B, los cebadores de la familia DH mostrados en la Fig. 4A, los 5 cebadores de la familia Vκ y los cebadores para INTR mostrados en la Fig. 5B, los cebadores para Vλ mostrados en la Fig. 6B, los cebadores de la familia Vγ mostrados en la Fig. 8B, los cebadores para Vδ y Dδ2 mostrados en la Fig. 9B, el cebador para BCL1/MTC mostrado en la Fig. 10A, y los cebadores para 3'MBR y mcr mostrados en la Fig. 11A y los cebadores inversos que comprenden los cebadores para JβA y JβB mostrados en la Fig. 7B, el cebador de consenso para JH mostrado en las Figuras 3B, 4A, 10A y la Fig. 11A, los cebadores para Jκ y Kde mostrados en la Fig. 5B, el cebador para Jλ mostrado en la Fig. 6B, los cebadores para Jγ mostrados en la Fig. 8B y los cebadores para Jδ y Dδ3 mostrados en la Fig. 9B

17. El conjunto de cebadores para amplificación de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 16, que comprende además los cebadores directos que comprenden a su vez los cebadores TBXAS1/X9U, RAG1/X2U, PLZF/X1U, AF4/X3U, AF4/X11U de la Fig. 12A y los cebadores inversos que comprenden a su vez los cebadores TBXAS1/X9L, RAG1/X2L, PLZF/X1L, AF4/X3L, AF4/X11L de la Fig. 12A.