Cebadores de amplificación de ácidos nucleicos para estudios de clonalidad basados en PCR del gen TCR-beta.

Un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar un reordenamiento de TCRBVß-Jß que comprende al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso,

en donde dicho cebador directose selecciona entre los cebadores de la familia Vß mostrados en la Fig. 7B, y en donde dicho cebador inverso seselecciona entre los cebadores JßA y JßB mostrados en la Fig. 7B..

Cebadores de amplificación de ácidos nucleicos para estudios de clonalidad basados en PCR del gen TCR-beta La presente invención se refiere a estudios de clonalidad basados en PCR para, entre otros, el diagnóstico precoz de trastornos linfoproliferativos. En la mayoría de los pacientes en los que se sospecha de trastornos linfoproliferativos, la histomorfología o la citomorfología complementadas con inmunohistología o inmunofenotipificación por citometría de flujo pueden discriminar entre linfoproliferaciones malignas y reactivas. Sin embargo, en 5 a 10% de los casos, realizar el diagnóstico es más complicado. El diagnóstico de las tumores malignos linfoides puede ser apoyado por la evaluación de la clonalidad basada en el hecho de que, en principio, todas las células de un tumor maligno tienen un origen clonal común.

La mayor parte de los tumores malignos linfoides pertenece al linaje de células B (90 a 95%) y solo una minoría pertenece al linaje de células T (5-7%) o el linaje de células NK (<2%) . Las leucemias linfoblásticas agudas (LLA) tienen su origen en las células T en 15 a 20% de los casos, pero en el grupo de las leucemias linfoides maduras y de los linfomas no Hodgkin (LNH) , los tumores malignos de células T son relativamente poco frecuentes, excepto en subgrupos específicos tales como los linfomas cutáneos (Tabla 1) . Por consiguiente, la gran mayoría de los tumores malignos linfoides (> 98%) contienen genes de inmunoglobulinas (Ig) y/o receptores de células T (TCR) idénticamente reorganizados (clonalmente) y en 25 a 30% de los casos también se encuentran aberraciones cromosómicas bien definidas, todos los cuales pueden servir como marcadores para la clonalidad

Los loci de genes de Ig y TCR contienen muchos segmentos de genes variables (V) , de diversidad (D) , y de unión

(J) diferentes, que se someten a procesos de reordenamiento durante la diferenciación linfoide temprana.3, 4 Los reordenamientos VDJ están mediados por un complejo de la enzima recombinasa en el que las proteínas RAG1 y RAG2 juegan un papel clave al reconocer y cortar el ADN en las secuencias señal de recombinación (RSS) , que se encuentran aguas abajo de los segmentos del gen V, a ambos lados de los segmentos del gen D, y aguas arriba de los segmentos del gen J (Figura 1) . Las RSS inapropiadas reducen o incluso evitan por completo el reordenamiento.

El proceso de reordenamiento comienza generalmente con un reordenamiento D a J seguido de un reordenamiento V a D-J en el caso de los genes de la cadena pesada de Ig (IGH) , TCR beta (TCRB) , y TCR delta (TCRD) (Figura 1)

o afectas a reordenamientos V a J directos en caso de los genes de Ig kappa (IGK) , Ig lambda (IGL) , TCR alfa (TCRA) , y TCR gamma (TCRG) . Las secuencias entre los segmentos de genes de reordenamiento son generalmente suprimidas en forma de un producto de escisión circular, también denominado círculo de escisión de TCR (TREC) o círculo escisión receptor de células B (BREC) (Figura 1) .

Los reordenamientos de los genes de Ig y TCR durante la diferenciación linfoide temprana siguen generalmente un orden jerárquico. Durante la diferenciación de las células B: primero se reordenan los genes de IGH, a continuación, los de IGK, dando como resultado potencialmente la expresión de IgH/κ o seguido de la deleción de IGK y el reordenamiento de IGL, potencialmente seguido de la expresión de IgH/λ.5 Esto implica que prácticamente todas las células B Igλ+ tienen deleciones del gen IGK monoalélicas o bialélicas. Durante la diferenciación de las células T: primero se reordenan los genes TCRD, a continuación, TCRG, dando como resultado potencialmente la expresión TCRγδ o seguido de un nuevo reordenamiento de TCRB y la deleción de TCRD con el subsiguiente reordenamiento de TCRA, seguido potencialmente por la expresión de TCRαβ. Los patrones de reordenamiento de los genes de Ig y TCR en los tumores malignos linfoides generalmente se ajustan al orden jerárquico descrito anteriormente, aunque también se encuentran patrones de reordenamiento inusuales, concretamente en la LLA.6

Las muchas combinaciones diferentes de los segmentos de los genes V, D, y J representan el denominado repertorio combinatorio (Tabla 2) , que se estima en ~ 2x106 para las moléculas de Ig, ~ 3x106 para las moléculas TCRαβ y ~ 5x103 para las moléculas de TCRγδ. En los sitios de unión de los segmentos de los genes V, D, y J, se produce la deleción e inserción al azar de nucleótidos durante el proceso de reordenamiento, lo que da como resultado regiones de unión muy diversas, que contribuyen significativamente al repertorio total de moléculas de Ig y TCR, que se estima que es >1012.5

Los linfocitos B maduros amplían adicionalmente su repertorio de Ig tras el reconocimiento del antígeno en los centros de los folículos por medio de hipermutación somática, un proceso que conduce a la maduración por afinidad de las moléculas de Ig. El proceso de hipermutación somática se centra en el exón V- (D-) J de los genes de IGH y de la cadena ligera de Ig y afecta a mutaciones de un único nucleótido y, a veces también a inserciones o deleciones de nucleótidos. También se encuentran genes de Ig mutados somáticamente en los tumores malignos de células B maduras de origen folicular o post-folicular.7

Los genes de Ig y TCR reordenados funcionalmente dan como resultado la expresión en la membrana superficial de moléculas Ig, TCRαβ, o TCRγδ. Basándose en el concepto de que solo un único tipo de molécula Ig o TCR es expresado por un linfocito o un clon de linfocito, los genes reordenados clonalmente de los tumores malignos linfoides maduros podrían ser detectables a nivel de proteínas. La detección de la expresión de la cadena ligera de Ig (Igκ o Igλ) sola se ha utilizado durante mucho tiempo para discriminar entre linfocitos B reactivos (policlonales) (razón Igκ/Igλ normal: 0, 7-2, 8) frente a linfocitos B aberrantes (clonales) con razones de Igλ/Igλ >4, 0 o <0, 5.8-10 En la

inmensa mayoría (>90%) de los tumores malignos de células B maduras, la expresión de la cadena ligera de Ig sola puede apoyar el origen clonal del tumor maligno.

Asimismo, el desarrollo de muchos anticuerpos diferentes contra dominios variables de las diversas cadenas de TCR permite la detección de los dominios Vβ, Vγ y Vδ monotípicos, cuando se compara con valores de referencia apropiados.11-18 En la interpretación de los resultados Vβ monotípico utilizando de 20 a 25 anticuerpos contra diferentes familias de Vβ (Tabla 2) , hay que darse cuenta de que las expansiones de las células T TCRαβ+ clonales clínicamente benignas (frecuentemente CD8+) se encuentran de manera regular en sangre periférica (SP) de individuos de más edad.13, 17 Estas expansiones de las células T clonales en SP tienen sin embargo un tamaño relativamente pequeño: <40% de linfocitos T de SP y <0, 5x106/ml de SP.13 Todavía no está claro hasta qué punto tales clones de células T clínicamente benignos pueden ser encontrados también en tejidos linfoides.

Los resultados de la expresión del dominio Vγ y Vδ monotípico deben ser interpretados con cautela, ya que en individuos sanos se ha seleccionado una gran fracción de linfocitos T TCRγδ+ policlonal normales para el uso de Vγ9-Jγ1.2 y Vδ2-Jδ1.18, 19 Por consiguiente, las elevadas frecuencias de linfocitos T Vγ9+/Vδ2+ en SP deben considerarse como un descubrimiento normal, a menos que los recuentos absolutos sean de 1 a 2x106/ml de SP. Se debe observar que la mayor parte de los tumores malignos de células T TCRγδ+ expresan Vδ1 u otro segmento del gen no Vδ2 combinado con un único dominio Vγ (generalmente no Vγ9) .15, 20

La detección de la expresión restringida Igκ o Igλ o expresión de Vβ, Vγ o Vδ monotípica es relativamente fácil en los estudios de citometría de flujo de muestras de SP y médula ósea (MO) de pacientes con leucemias de células B

o de células T maduras. Sin embargo, esto parece ser más difícil en muestras de tejido en las que se sospecha de trastornos linfoproliferativos que se entremezclan con linfocitos normales (reactivos) .

En contraste con las técnicas basadas en anticuerpos, las técnicas moleculares son ampliamente aplicables para la detección de los genes de Ig/TCR reordenados clonalmente, así como aberraciones cromosómicas bien definidas. Esto tenía que ver previamente con el análisis mediante transferencia Southern, pero hoy en día se utilizan concretamente... [Seguir leyendo]

1. Un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar un reordenamiento de TCRB Vβ-Jβ que comprende al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona entre los cebadores de la familia Vβ mostrados en la Fig. 7B, y en donde dicho cebador inverso se selecciona entre los cebadores JβA y JβB mostrados en la Fig. 7B.

2. El conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cebador inverso se selecciona entre los cebadores JβA mostrados en la Fig. 7B.

3. El conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cebador inverso se selecciona entre los cebadores JβB mostrados en la Fig. 7B.

4. El conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleicos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende adicionalmente un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar un reordenamiento de TCRB Dβ-Jβ que comprende al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona entre los cebadores Dβ1 o Dβ2 mostrados en la Fig. 7B, y en donde dicho cebador inverso se selecciona entre los cebadores JβA y JβB mostrados en la Fig. 7B.

5. Un análisis de amplificación de ácido nucleico, preferiblemente un análisis de PCR, más preferiblemente un análisis de PCR múltiplex, que utiliza al menos un conjunto de cebadores de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3, o

4.

6. El análisis de amplificación de ácido nucleico de la reivindicación 5, caracterizado por que es un análisis de PCR.

7. El análisis de amplificación de ácido nucleico de la reivindicación 5 o 6, caracterizado por que es un análisis de

PCR múltiplex, que comprende adicionalmente uno o más de los conjuntos de cebadores seleccionados del grupo que consiste en:

a. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar un reordenamiento de IGH VH-JH que comprende al menos un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona entre los miembros de la familia de VH mostrados en la Fig. 3B, y en donde dicho cebador inverso es el cebador consenso JH mostrado en la Fig. 3B.

b. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar un reordenamiento de IGH DH-JH que comprende al menos un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona entre los cebadores de la familia DH mostrados en la Fig. 4A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador consenso JH mostrado en la Fig. 4A.

c. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar un reordenamiento de IGK VK-JK que comprende al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona entre los cebadores VK de la familia mostrados en la Fig. 5B, y en donde dicho cebador inverso se selecciona entre entre los cebadores Jκ mostrados en la Fig. 5B.

d. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar un reordenamiento de IGK

VK/Intrón-Kde que comprende al menos un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona entre los cebadores VK o el cebador INTR mostrado en la Fig. 5B, y en donde dicho cebador inverso es el cebador Kde mostrado en la Fig. 5B.

e. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar un reordenamiento de IGL Vλ-Jλ que comprende al menos un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona entre los cebadores Vλ mostrados en la Fig. 6B, y en donde dicho cebador inverso es el cebador Jλ mostrado en la Fig. 6B.

f. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar un reordenamiento de TCRG Vγ-Jγ que comprende al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona entre los cebadores de la familia Vγ mostrados en la Fig. 8B, y en donde dicho cebador

inverso se selecciona entre los cebadores Jγ mostrados en la Fig. 8B.

g. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar un reordenamiento de TCRD Vδ-Jδ que comprende al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona entre los cebadores Vδ mostrados en la Fig. 9B, y en donde dicho cebador inverso se selecciona entre los cebadores Jδ mostrados en la Fig. 9B.

h. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar un reordenamiento de TCRD Dδ-Dδ que comprende un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador Dδ2 mostrado en la Fig. 9B, y en donde dicho cebador inverso es el cebador Dδ3 mostrado en la Fig. 9B.

i. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar un reordenamiento de TCRD Dδ-Jδ que comprende un cebador directo y al menos un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador Dδ2 mostrado en la Fig. 9B, y en donde dicho cebador inverso se selecciona entre los cebadores Jδ mostrados en la Fig. 9B.

j. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar un reordenamiento de TCRD Vδ-Dδ que comprende al menos un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona entre los cebadores Vδ mostrados en la Fig. 9 B, y en donde dicho cebador inverso es el cebador Dδ3 mostrado en la Fig. 9B.

k. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar una translocación cromosómica (11;14) (BCL1-IGH) que comprende un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador BCL1/MTC como se muestra en la Fig. 10A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador consenso JH mostrado en la Fig. 10A.

l. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar una translocación cromosómica t (14;18) (BCL2-IGH) , que comprende al menos un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo se selecciona entre los cebadores MBR, los cebadores 3'MBR y los cebadores mcr mostrados en la Fig. 11A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador consenso JH mostrado en la Fig. 11A.

m. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar el gen TBXAS1 humano que comprende un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador TBXAS1/X9U de la Fig. 12A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador TBXAS1/X9L de la Fig. 12A.

n. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar el gen de la proteína activadora de la recombinación humana (RAG1) que comprende un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador RAG1/X2U de la Fig. 12A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador RAG1/X2L de la Fig. 12A.

o. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar proteína de dedo de zinc de la leucemia promielocítica humana (PLZF) que comprende un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador PLZF/X1U de la Fig. 12A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador PLZF/X1L de la Fig. 12A.

p. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar el gen AF4 humano (exón 3) que comprende un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador AF4/X3U de la Fig. 12A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador AF4/X3L de la Fig. 12A.

q. un conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico capaz de amplificar el gen AF4 humano (exón 11) que comprende un cebador directo y un cebador inverso, en donde dicho cebador directo es el cebador AF4/X11U de la Fig. 12A, y en donde dicho cebador inverso es el cebador AF4/X11L de la Fig. 12A.

8. Un método para detectar un reordenamiento de TCRB Vβ-Jβ, que comprende el uso de uno o más conjuntos de cebadores de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 en un análisis de amplificación de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-7.

9. Un método para detectar un reordenamiento TCRB Dβ-Jβ, que comprende el uso de conjuntos de cebadores de acuerdo con la reivindicación 4 en un análisis de amplificación de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-7.

10. Un método para detectar dos o más reordenamientos, dos o más translocaciones o al menos un reordenamiento y al menos una translocación, seleccionados del grupo que consiste de un reordenamiento de IGH VH-JH, un reordenamiento de IGH DHJH, un reordenamiento de IGK VK-JK, un reordenamiento de IGK VK/Intrón-Kde, un reordenamiento de IGL Vλ-Jλ, un reordenamiento de TCRB Vβ-Jβ, un reordenamiento de TCRB Dβ-Jβ, un reordenamiento de TCRG Vγ-Jγ, un reordenamiento de TCRD Vδ-Jδ, un reordenamiento de TCRD Dδ-Dδ, un reordenamiento de TCRD Dδ-Jδ, un reordenamiento de TCRD Vδ-Dδ, una translocación t (11, 14) (BCL1-IGH) y una translocación t (14;18) (BCL2-IGH) , utilizando un análisis de amplificación nucleico de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho reordenamiento comprende al menos un reordenamiento de TCRB Vβ-Jβ.

11. Un método para evaluar reordenamientos clonales, que comprende al menos un reordenamiento de TCRB VβJβ, y/o aberraciones cromosómicas utilizando al menos el conjunto de cebadores de acuerdo con la reivindicación 1, y opcionalmente al menos un conjunto de cebadores como se define en las reivindicaciones 4 .

7. 7q.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11 para la detección de enfermedad residual mínima (ERM) o para la identificación de dianas de la PCR que se van a utilizar para la detección de ERM a través de PCR cuantitativa en tiempo real.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde un ácido nucleico amplificado se detecta utilizando un análisis de fragmentos de PCR de alta resolución automatizado.

14. Un kit para la detección de al menos un reordenamiento de TCRB Vβ-Jβ y opcionalmente un reordenamiento seleccionado del grupo que consiste en, un reordenamiento de IGH VH-JH, un reordenamiento de IGH DHJH, un 5 reordenamiento de IGK VK-JK, un reordenamiento de IGK VK/Intrón-Kde, un reordenamiento de IGL Vλ-Jλ, un reordenamiento de TCRB Dβ-Jβ, un reordenamiento de TCRG Vγ-Jγ, un reordenamiento de TCRD Vδ-Jδ, un reordenamiento de TCRD Dδ-Dδ, un reordenamiento de TCRD Dδ-Jδ, un reordenamiento de TCRD Vδ-Dδ, y una translocación seleccionada entre t (11, 14) (BCL1-IGH) y t (14;18) (BCL2-IGH) , que comprende el uso de al menos el conjunto de cebadores de acuerdo con la reivindicación 1, y opcionalmente al menos un conjunto de cebadores como se define en las reivindicaciones 4 .

7. 71.

15. Un kit de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende adicionalmente al menos un conjunto de cebadores como se define en la reivindicació.

7. 7q.

16. El uso de un método de acuerdo con la reivindicación 11 para evaluar la calidad de una muestra de ADN extraído de una muestra biológica, preferiblemente una muestra biológica incluida en parafina.

17. El conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente cebadores directos que comprenden los cebadores Dβ1 y Dβ2 mostrados en la Fig. 7B, los cebadores de la familia VH mostrados en la Fig. 3B, los cebadores de la familia DH mostrados en la Fig. 4A, los cebadores de la familia VK e INTR mostrados en la Fig. 5B, los cebadores Vλ mostrados en la Fig. 6B, los cebadores de la familia Vγ mostrados en la Fig. 8B, los cebadores Vδ y Dδ2 mostrados en la Fig. 9B, el cebador BCL1/MTC

mostrado en la Fig. 10A, y los cebadores 3'MBR y mcr mostrados en la Fig. 11A y cebadores inversos que comprenden los cebadores JβA y JβB mostrados en la Fig. 7B, el cebador consenso JH mostrado en las Figs. 3B, 4A, 10A, y la Fig. 11A, los cebadores Jκ y Kde mostrados en la Fig. 5B, el cebador Jλ mostrado en la Fig. 6B, los cebadores Jγ mostrados en la Fig. 8B y los cebadores Jδ y Dδ3 mostrados en la Fig. 9B.

18. El conjunto de cebadores de amplificación de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 1 o la reivindicación 17, que comprende adicionalmente cebadores directos que comprenden los cebadores TBXAS1/X9U, RAG1/X2U, PLZF/X1U, AF4/X3U, AF4/X11U de la Fig. 12A y los cebadores inversos que comprenden los cebadores TBXAS1/X9L, RAG1/X2L, PLZF/X1L, AF4/X3L, AF4/X11L de la Fig. 12A.