Anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína de mantenimiento de minicromosomas 2 y métodos para su uso en la detección de enfermedades cervicales.

Un anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse específicamente al mantenimiento de minicromosomas 2,

donde el anticuerpo se selecciona entre:

(a) el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 26H6.19, depositada en la ATCC con el Núm. de Depósito de Patente PTA-6667;

(b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo dentro de la secuencia del SEQ ID NO: 14; y

(c) un anticuerpo monoclonal que compite en un análisis de unión competitiva con el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 26H6.19; o

(e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de (a) - (c) donde el fragmento conserva la capacidad de unirse específicamente al mantenimiento de minicromosomas.

Anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína de mantenimiento de minicromosomas 2 y métodos para su uso en la detección de enfermedades cervicales.

Campo de la invención La invención se refiere a anticuerpos capaces de unirse a MCM2 y a métodos de uso de estos anticuerpos, concretamente en el diagnóstico de enfermedades cervicales.

Antecedentes de la Invención El carcinoma de cérvix es el segundo neoplasma más común en mujeres, representando aproximadamente un 12% de todos los cánceres femeninos y ocasionando aproximadamente 250.000 muertes por año. Baldwin et al. (2003) Nature Reviews Cancer 3: 1-10. En muchos países en desarrollo en los que todavía no se encuentran disponibles programas de escrutinio masivo, el problema clínico es más serio. El cáncer cervical en estos países es la causa número uno de muerte en mujeres.

La mayoría de los casos de cáncer cervical representan carcinomas de células escamosas, aunque también se observan adenocarcinomas. El cáncer cervical puede ser evitado por medio de escrutinio de la población ya que éste evoluciona a través de fases intraepiteliales no invasivas bien definidas, que pueden ser distinguidas morfológicamente. Williams et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14932-14937. Si bien no se conoce cómo se transforman las células normales, el concepto de un espectro continuo de cambios histopatológicos a partir del epitelio estratificado, normal por medio de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) a cáncer invasivo ha sido ampliamente aceptado durante años. El precursor del cáncer cervical es la displasia, también conocida en la técnica como NIC o lesiones intraepiteliales escamosas (LIE) . Las anomalías intraepiteliales escamosas se pueden clasificar utilizando el sistema triple (NIC) o doble (Bethesda) . En el sistema Bethesda, las lesiones intraepiteliales escamosas de grado bajo (LLIE) , que corresponden a NICI e infección por VPH, generalmente representan infecciones por VPH productivas con un riesgo de progreso relativamente bajo a enfermedad invasiva. Las lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado (HLIE) , que corresponden a NICII y NICIII en el sistema triple, muestran un riego de progreso mayor a cáncer cervical que LLIE, aunque tanto LLIE como HLIE se contemplan como precursores potenciales de malignidad. Las muestras de los pacientes también se pueden clasificar como ASCUS (células escamosas atípicas de importancia no determinada) o AGUS (células glandulares atípicas de importancia no determinada) con este sistema.

Se ha establecido una fuerte asociación del cáncer cervical y la infección por tipos de virus de papiloma humano (HPV) de alto riesgo, tales como los tipos 16, 18, y 31. De hecho, un gran cúmulo de evidencias epidemiológicas y de biología molecular ha establecido la infección por VPH como un factor causal en la enfermedad cervical. Por otra parte, el VPH se encuentra en un 85% o más de los casos de enfermedad cervical de alto grado. Sin embargo, la infección por VPH es muy común, produciéndose en un 5-15% de las mujeres de más de 30 años de edad, pero pocas mujeres positivas al VPH desarrollarán alguna vez una enfermedad cervical de alto grado o cáncer. La presencia de VPH solo es indicativa únicamente de infección, no de enfermedad cervical de alto grado, y, por lo tanto, el ensayo para la infección para VPH solo da como resultado muchos falsos positivos. Véase, por ejemplo, Wright et al. (2004) Obstet. Gynecol. 103: 304-309.

Las publicaciones actuales sugieren que el VPH infecta las células pluripotenciales basales dentro del tejido subyacente del cérvix uterino. La diferenciación de las células pluripotenciales en queratinocitos maduros, con la migración resultante de las células al epitelio cervical estratificado, está asociada con la replicación viral del VPH y la re-infección de las células. Durante este proceso de replicación viral, se producen numerosos cambios celulares que incluyen la desregulación del ciclo, la proliferación activa, la replicación del ADN, la activación transcripcional y la inestabilidad genómica (Crum (2000) Modern Pathology 13: 243-251; Middleton et al. (2003) J. Virol. 77: 1018610201; Pett et al. (2004) Cancer Res. 64: 1359-1368) .

La mayor parte de las infecciones por VPH tienen una naturaleza transitoria, resolviéndose la infección viral por si misma en un período de 12 meses. Para aquellos individuos que desarrollan infecciones persistentes con uno o más subtipos oncogénicos de VPH, existe el riesgo de desarrollo de neoplasia en comparación con los pacientes sin infección por VPH. Dada la importancia del VPH en el desarrollo de neoplasia cervical, la detección clínica del VPH se ha convertido en una importante herramienta de diagnóstico en la identificación de pacientes con riesgo de desarrollo de neoplasia cervical. La utilidad clínica del escrutinio basado en el VPH para enfermedades cervicales se encuentra en su valor predictivo negativo. Un resultado negativo para el VPH combinado con una historia de pruebas de Papanicolau normales es un indicador excelente de un estado libre de enfermedad y un bajo riesgo de desarrollo de neoplasia cervical durante los 1-3 años siguientes. Sin embargo, un resultado positivo para el VPH no es un diagnóstico de enfermedad cervical; en lugar de eso es una indicación de infección. Aunque la mayor parte de las infecciones por VPH es transitoria y se aclarará espontáneamente en un período de 12 meses, una infección persistente con un subtipo viral de VPH de alto riesgo indica un riesgo mayor de desarrollo de neoplasia cervical. Para complementar el ensayo de VPH, se espera que la identificación de marcadores moleculares asociados con la neoplasia cervical mejore la especificidad clínica para la diagnosis de las enfermedades cervicales.

El examen citológico de frotis cervical teñido de Papanicolaou (prueba de Papanicoloau) actualmente es el método de elección para detectar el cáncer cervical. La prueba de Papanicolau es un método subjetivo que ha permanecido esencialmente inalterado durante 60 años. Existen numerosas cuestiones, no obstante, referentes a su funcionamiento. La sensibilidad referida de una única prueba de Papanicolau (la proporción de positivos para la enfermedad que son positivos para la prueba) es baja y muestra una amplia variación (30-87%) . La especificidad de una única prueba de Papanicolau (la proporción de negativos para la enfermedad que son negativos para la prueba) podría ser tan baja como un 86% en una población en escrutinio y considerablemente más baja en la población ASCUS PLUS para la determinación de enfermedad de alto grado subyacente. Véase, Baldwin et al., supra. Un porcentaje significativo de pruebas de Papanicolau caracterizadas como LLIE o NICI son realmente positivas para lesiones de alto grado. Además, hasta un 10% de las pruebas de Papanicolau se clasifican como ASCUS (células escamosas atípicas de importancia no determinada) , esto es, no es posible realizar una clasificación clara como lesión normal, moderada o grave, o tumor. No obstante, la experiencia demuestra que hasta el 10% de esta población ASCUS tiene lesiones de alto grado, que por consiguiente son pasadas por alto. Véase, por ejemplo, Manos et al. (1999) JAMA 281: 1605-1610. Por lo tanto, se necesitan biomarcadores moleculares que sean expresados en exceso selectivamente en las enfermedades cervicales de alto grado y composiciones para la detección de estos biomarcadores, para poner en práctica métodos fiables para el diagnóstico de enfermedades cervicales de alto grado.

Las proteínas de mantenimiento de minicromosomas (MCM) juegan un papel esencial en la replicación del ADN eucariótico. Las proteínas de mantenimiento de minicromosomas (MCM) funcionan en las fases tempranas de la replicación del ADN por medio de la carga del complejo de pre-replicación sobre el ADN y actuando como una helicasa para ayudar a desenrollar el ADN dúplex durante la síntesis de novo de la hebra de ADN duplicada. Cada una de las proteínas MCM tiene motivos ATPasa dependientes de ADN en su dominio central altamente conservado. Los niveles de proteínas MCM generalmente aumentan de una manera variable a medida que las células normales progresan de la fase G0 a la G1/S del ciclo celular. En la fase G0, las proteínas MCM2 y MCM5 son mucho menos abundantes que las proteínas MCM7 y MCM3. MCM6 forma un complejo con MCM2, MCM4, y MCM7, que une la histona H3. Además, el subcomplejo de MCM4, MCM6, y MCM7 tiene actividad helicasa, que está mediada por la actividad de unión a ATP de MCM6 y la actividad de unión a ADN de MCM4. Véanse, por ejemplo, Freeman et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2121-2132; Lei et al. (2001) J. Cell Sci. 114: 1447-1454; Ishimi et al. (2003) Eur. J. Biochem. 270: 1089-1101.... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse específicamente al mantenimiento de minicromosomas 2, donde el anticuerpo se selecciona entre:

(a) el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 26H6.19, depositada en la ATCC con el Núm. de Depósito de Patente PTA-6667;

(b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo dentro de la secuencia del SEQ ID NO: 14; y

(c) un anticuerpo monoclonal que compite en un análisis de unión competitiva con el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 26H6.19; o

(e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de (a) - (c) donde el fragmento conserva la capacidad de unirse específicamente al mantenimiento de minicromosomas.

2. La línea celular de hibridoma 26H6.19, depositada en la ATCC con el Núm. de Depósito de Patente PTA-6667.

3. Una línea celular de hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1.

4. Un kit para diagnosticar una enfermedad cervical de alto grado que comprende al menos un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1.

5. El kit de la reivindicación 4, donde el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 26H6.19, depositada en la ATCC con el Núm. de Depósito de Patente PTA-6667.

6. El kit de la reivindicación 4, que comprende al menos dos anticuerpos, donde un primer anticuerpo es el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 27C5.6, depositada en la ATCC con el Núm. de Depósito de Patente PTA-6668, y un segundo anticuerpo es el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 26H6.19 depositada en la ATCC con el Núm. de Depósito de Patente PTA-6667.

7. El kit de la reivindicación 6, que comprende adicionalmente un anticuerpo que se une específicamente a la topoisomerasa alfa II.

8. El kit de la reivindicación 6, donde cada anticuerpo se proporciona en forma de un reactivo de anticuerpo separado, o donde todos los anticuerpos se proporcionan en forma de un cóctel de anticuerpos.

9. El kit de la reivindicación 4, donde dicho kit comprende adicionalmente un reactivo de bloqueo de peroxidasa, un reactivo de bloqueo de proteína, agentes químicos para la detección de la unión del anticuerpo al mantenimiento de minicromosomas 2, una contratinción, un agente de añil, e instrucciones para su uso.

10. El kit de la reivindicación 4, que comprende adicionalmente reactivos para la tinción de Papanicolaou, donde los reactivos para la tinción de Papanicolaou comprenden preferiblemente alcohol-eosina 50 y Orange G.

11. Un método para diagnosticar una enfermedad cervical de alto grado en un paciente, comprendiendo el método:

a) poner en contacto in vitro una muestra obtenida del paciente con al menos un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1, que se une específicamente al mantenimiento de minicromosomas 2; y, b) detectar la unión del anticuerpo al mantenimiento de minicromosomas 2.

12. El método de la reivindicación 11, donde el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 26H6.19, depositada en la ATCC con el Núm. de Depósito de Patente PTA-6667.

13. El método de la reivindicación 11, que comprende poner en contacto la muestra con al menos dos anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al mantenimiento de minicromosomas 2, donde un primer anticuerpo es el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 27C5.6, depositada en la ATCC con el Núm. de Depósito de Patente PTA-6668, y un segundo anticuerpo es el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 26H6.19 depositada en la ATCC con el Núm. de Depósito de Patente PTA-6667.

14. El método de la reivindicación 13, que comprende adicionalmente poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une específicamente a la topoisomerasa alfa II.

15. El método de la reivindicación 13, donde los anticuerpos se ponen en contacto con la muestra sucesivamente en forma de reactivos de anticuerpo individuales o simultáneamente en forma de cóctel de anticuerpos.