Un método para diagnosticar enfermedades de cuello uterino de alto grado en una paciente,

comprendiendo dicho método:

a) poner en contacto una muestra corporal de dicha paciente al menos con tres anticuerpos, en el que un primer y segundo anticuerpo se unen específicamente a la proteína 2 de mantenimiento de minicromosomas MCM2 y un tercer anticuerpo que se une específicamente a la toposiomerasa II alfa, Topo2A; y,

b) detectar la unión de los anticuerpos a MCM2 y a Topo2A.

Métodos y composiciones para la detección de enfermedades de cuello uterino

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y a composiciones para la detección de enfermedades de cuello uterino de alto grado.

Antecedentes de la invención

El carcinoma de cuello uterino es el segundo neoplasma más común en mujeres, representando aproximadamente un 12% de todos los cánceres en mujeres y ocasionando aproximadamente 250.000 muertes por año. Baldwin et al (2003) Nature Reviews Cancer 3:1-10. En muchos países en desarrollo en los que no se dispone de programas de exploración masiva, el problema clínico es más serio. En estos países, el cáncer de cuello uterino es la causa número uno de muerte por cáncer en mujeres.

La mayoría de los casos de cáncer de cuello uterino representan carcinomas de células escamosas, aunque también se observan adenocarcinomas. El cáncer de cuello uterino puede prevenirse por exploración de la población a medida que evoluciona a través de fases intraepiteliales no invasivas bien definidas, que pueden diferenciarse morfológicamente. Williams et al (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14932-14937. Si bien no se conoce cómo se transforman las células normales, el concepto de un espectro continuo de cambios histopatológicos a partir del epitelio estratificado, normal por medio de neoplasia intraepitelial de cuello uterino (CIN) a cáncer invasivo se ha aceptado ampliamente durante años. El precursor del cáncer de cuello uterino es la displasia, conocida también en la técnica como CIN o lesiones intraepiteliales escamosas (SIL) . Las anomalías intraepiteliales escamosas pueden clasificarse usando el sistema triple (CIN) o doble (Bethesda) . En el sistema Bethesda, las lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (LSIL) , que corresponden a CINI e infección por el VPH, generalmente representan infecciones por el VPH productivas con un riesgo de progreso relativamente bajo hacia una enfermedad invasiva. Las lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado (LSIL) , que corresponden a CINII y CINIII en el sistema triple, muestran un riesgo de progreso mayor a cáncer de cuello uterino que las LSIL, aunque tanto las LSIL como las HSIL se contemplan como precursores potenciales de malignidad. Las muestras de los pacientes también pueden clasificarse como ASCUS (células escamosas atípicas de significado desconocido) o AGUS (células glandulares atípicas de significado desconocido) con este sistema.

Se ha establecido una fuerte asociación del cáncer e infección de cuello uterino por tipos de virus de papiloma humano (VPH) de alto riesgo, tales como los tipos 16, 18 y 31. De hecho, un gran cúmulo de pruebas epidemiológicas y de biología molecular ha establecido la infección por VPH como un factor causal en el cáncer de cuello uterino. Por otra parte, el VPH se encuentra en un 85% o más de los casos de enfermedad de cuello uterino de alto grado. Sin embargo, la infección por VPH es muy habitual, produciéndose posiblemente en un 5-15% de las mujeres de más de 30 años de edad, pero pocas mujeres positivas al VPH desarrollarán alguna vez una enfermedad de cuello uterino de alto grado o cáncer. La presencia del VPH solo es indicativa únicamente de infección, no de enfermedad de cuello uterino de alto grado, y, por lo tanto, el ensayo para detectar infección por el VPH solo da como resultado muchos positivos falsos. Véase, por ejemplo, Wright et al (2004) Obstet Gynecol 103:304-309.

45 Las publicaciones actuales sugieren que el VPH infecta las células madre basales dentro del tejido subyacente del cuello uterino. La diferenciación de las células madre en queratinocitos maduros, con la migración resultante de las células al epitelio del cuello uterino estratificado, está asociada con la replicación viral del VPH y la re-infección de las células. Durante este proceso de replicación viral, se producen numerosos cambios celulares que incluyen la desregulación del ciclo celular, la proliferación activa, la replicación del ADN, la activación transcripcional y la inestabilidad genómica (Crum (2000) Modern Pathology 13:243-251; Middleton et al (2003) J. Virol. 77:10186-10201; Pett et al (2004) Cancer Res. 64:1359-1368) .

La mayor parte de las infecciones por el VPH tienen una naturaleza transitoria, resolviéndose la infección viral por sí misma en un período de 12 meses. Para aquellos individuos que desarrollan infecciones persistentes con uno o más 55 subtipos oncogénicos del VPH, existe el riesgo de desarrollo de neoplasia en comparación con los pacientes sin infección por el VPH. Dada la importancia del VPH en el desarrollo de neoplasia de cuello uterino, la detección clínica del VPH se ha convertido en una importante herramienta de diagnóstico en la identificación de pacientes con riesgo de desarrollo de neoplasia de cuello uterino. La utilidad clínica de la exploración basada en el VPH para enfermedades del cuello uterino se encuentra en su valor predictivo negativo. Un resultado negativo para el VPH combinado con un historial de frotis de Papanicolau normales es un indicador excelente de un estado libre de enfermedad y un bajo riesgo de desarrollo de neoplasia de cuello uterino durante los 1-3 años siguientes. Sin embargo, un resultado positivo para el VPH no es un diagnóstico de enfermedad de cuello uterino sino una indicación de infección. Aunque la mayoría de las infecciones por VPH son transitorias y se eliminarán espontáneamente en un periodo de 12 meses, una infección persistente con un subtipo viral de VPH de alto riesgo 65 indica un riesgo mayor de desarrollo de neoplasia de cuello uterino. Para complementar el ensayo del VPH, se espera que la identificación de marcadores moleculares asociados con la neoplasia de cuello uterino mejore la especificidad clínica para la diagnosis de las enfermedades de cuello uterino.

El examen citológico de frotis de cuello uterino teñido con Papanicolau (frotis de Pap) es actualmente el método de elección para detectar el cáncer de cuello uterino. El ensayo de Pap es un método subjetivo que ha permanecido 5 sustancialmente inalterado durante 60 años. Sin embargo, existen numerosas cuestiones, en lo que respecta a su realización. La sensibilidad referida de un único ensayo de Pap (la proporción de positivos para la enfermedad que es positiva para el ensayo) es baja y muestra una amplia variación (30-87%) . La especificidad de un solo ensayo de Pap (la proporción de negativos para la enfermedad que son negativos para el ensayo) podría ser tan baja como un 86% en una población en exploración y considerablemente más baja en la población ASCUS PLUS para la determinación de enfermedades de alto grado subyacentes. Véase, Baldwin et al., anteriormente. Un porcentaje significativo de frotis de Pap caracterizados como LSIL o CINI son realmente positivos para lesiones de alto grado. Además, hasta un 10% de los frotis de Pap se clasifican como ASCUS (células escamosas atípicas de significado no determinado) , es decir, no es posible realizar una clasificación clara como lesión normal, moderada o grave, o tumor. Sin embargo, la experiencia demuestra que hasta el 10% de esta población ASCUS tiene lesiones de alto grado, que por consiguiente se pasan por alto. Véase, por ejemplo, Manos et al (1999) JAMA 281:1605-1610.

El documento de Baldwin P et al (2003) , Nature Reviews, vol. 3 págs. 217-226 describe intentos para mejorar la exploración de cuello uterino. El documento WO02101075 describe genes, composiciones, kits y métodos en relación con el cáncer de cuello uterino. El documento de Santin A et al describe marcadores moleculares candidatos para el diagnóstico del cáncer de cuello uterino.

Por lo tanto, se necesita un método para el diagnóstico de enfermedades de cuello uterino de alto grado que sea independiente de o que funcione junto con los frotis de Pap y ensayos moleculares convencionales para la infección por VPH de alto riesgo. Tal método debe ser capaz de identificar específicamente enfermedades de cuello uterino de alto grado que estén presentes en todas las poblaciones de pacientes, incluyendo aquellos casos clasificados como LSIL o CINI por tinción con Pap que sean realmente positivos para lesiones de alto grado (es decir, "negativos falsos") . Por lo tanto, en la materia existe una necesidad de métodos de diagnóstico específicos, fiables que sean capaces de detectar enfermedades de cuello uterino de alto grado y de diferenciar enfermedades de alto grado de afecciones que no se consideran enfermedades clínicas, tales como infección por VPH de fase temprana y displasia leve.

Sumario de la invención

1. Un método para diagnosticar enfermedades de cuello uterino de alto grado en una paciente, comprendiendo dicho método:

a) poner en contacto una muestra corporal de dicha paciente al menos con tres anticuerpos, en el que un primer y segundo anticuerpo se unen específicamente a la proteína 2 de mantenimiento de minicromosomas MCM2 y un tercer anticuerpo que se une específicamente a la toposiomerasa II alfa, Topo2A; y, b) detectar la unión de los anticuerpos a MCM2 y a Topo2A.

2. El método de la reivindicación 1, en el que los al menos tres anticuerpos son anticuerpos monoclonales.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el método comprende realizar inmunocitoquímica.

4. El método de la reivindicación 1, 2 ó 3 en el que el método se realiza manualmente; o en el que el método se realiza de manera automatizada.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra comprende células de cuello uterino; preferentemente una monocapa de células de cuello uterino.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra comprende células de cuello uterino en suspensión en una preparación basada en líquido o una muestra tisular de cuello uterino.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la sensibilidad de dicho método, para diagnosticar una enfermedad de cuello uterino de alto grado, es de al menos el 90%; o en el que la especificidad de dicho método, para diagnosticar una enfermedad de cuello uterino de alto grado, es de al menos el 85%.

8. El método de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende efectuar tinción de Papanicolaou (Pap) de la muestra.

9. El método de la reivindicación 1, en el que dichos al menos tres anticuerpos se ponen en contacto con dicha muestra secuencialmente, como reactivos de anticuerpos individuales; o en el que dichos anticuerpos se ponen en contacto con dicha muestra simultáneamente, como un cóctel de anticuerpos.

10. El método de la reivindicación 1, en el que el método se realiza en respuesta a una paciente que tiene un resultado anómalo en un ensayo de frotis Pap, o en el que el método se realiza como una exploración primaria para detectar una enfermedad de cuello uterino de alto grado en una población general de pacientes.

11. Un kit que comprende al menos tres anticuerpos, en el que un primer y un segundo anticuerpo, incluidos en el kit, se unen específicamente a MCM2 y en el que un tercer anticuerpo se une específicamente a Topo2A.

12. El kit de la reivindicación 11, en el que los al menos tres anticuerpos son anticuerpos monoclonales.

13. El kit de la reivindicación 11, en el que dicho kit comprende adicionalmente un reactivo bloqueador de peroxidasa, un reactivo bloqueador de proteína, productos químicos para la detección de la unión de anticuerpos a dichas proteínas biomarcadoras, un colorante de contraste, un agente colorante azul e instrucciones para su uso.

14. El kit de la reivindicación 13, en el que para la detección de la unión de anticuerpos, dichos productos químicos comprendeN un cromógeno y un anticuerpo secundario conjugado con un polímero marcado, en el que el cromógeno comprende 3', 3'-diaminobencidina y en el que el polímero marcado comprende peroxidasa de rábano picante conjugada con un polímero de dextrano; dicho colorante de contraste comprende hematoxilina; o en el que dicho agente colorante azul comprende una solución que comprende solución salina tamponada con Tris, pH 7, 4, Tween-20 y azida sódica.

15. El kit de la reivindicación 11 ó 13 que comprende adicionalmente una muestra de control positivo; en la que preferentemente dicha muestra de control positivo comprende células SiHa.

16. El kit de la reivindicación 11 ó 13 que adicionalmente comprende reactivos para tinción Pap; en el que preferentemente los reactivos para tinción Pap comprenden EA50 y Orange G.

17. El kit de la reivindicación 11 ó 13, en el que dichos al menos tres anticuerpos se proporcionan como reactivos individuales; o en el que dichos al menos tres anticuerpos se proporcionan como un cóctel.

18. Un método para usar el kit de la reivindicación 11 ó 13 para diagnosticar enfermedades de cuello uterino de alto grado en una muestra procedente de una paciente, que comprende poner en contacto dicha muestra con dichos al menos tres anticuerpos.