Recubrimientos poliméricos policatiónicos para inmovilizar muestras biológicas.

Un procedimiento para preparar un sustrato recubierto adaptado para inmovilizar una muestra biológica,

comprendiendo dicho procedimiento:

proporcionar un sustrato con una superficie que comprende una pluralidad de grupos aniónicos;poner en contacto el sustrato con una composición que comprende una disolución de un material poliméricocatiónico no peptídico, teniendo la disolución un pH de 8 a 14, para formar un recubrimiento del materialpolimérico no peptídico en al menos una porción de la superficie del sustrato;

secar el recubrimiento del material polimérico no peptídico; y

aclarar el sustrato con el recubrimiento del material polimérico no peptídico seco sobre el mismo, donde elrecubrimiento del material polimérico no peptídico esta posicionado para inmovilizar una muestra biológica.

Recubrimientos poliméricos policatiónicos para inmovilizar muestras biológicas

Campo de la invención La invención presente invención está dirigida a un procedimiento para preparar un sustrato recubierto para inmovilizar una muestra biológica en el mismo, preferentemente para el análisis de la misma. La presente invención está dirigida adicionalmente a un sustrato prerrecubierto preparado según el procedimiento anterior. El sustrato se recubre con un polímero policatiónico que proporciona una capa de polímero estable capaz de una interacción iónica con componentes biológicos aniónicos.

Antecedentes Diversas técnicas preparatorias biológicas requieren la inmovilización de materiales de muestra, tales como células, tejidos, proteínas o ácidos nucleicos, a un sustrato antes del subsiguiente procesado. Muchos de estos materiales biológicos de interés son de naturaleza aniónica, mostrando sitios con carga neta negativa. Un procedimiento de inmovilización de estos materiales es recubrir el sustrato objetivo con una disolución química que contiene principios activos que son de naturaleza catiónica, mostrando una carga neta positiva. Dado que los materiales biológicos de interés que se van a inmovilizar muestran sitios de carga neta negativa, los materiales biológicos se unen a la superficie del sustrato mediante la interacción con los sitios de carga neta positiva de la disolución de recubrimiento. Esta propiedad de adhesión de la disolución de recubrimiento permite la inmovilización del material de muestra para su subsiguiente procesado.

El efecto de inmovilización descrito anteriormente puede crearse mediante el uso de recubrimientos que contienen varios principios activos conocidos actualmente en la técnica. Por ejemplo, actualmente se conoce el uso de agentes de recubrimiento, tales como poli-1-lisina, 3-aminopropil trietoxisilano, gelatina de cromo y aluminio, y albúmina blanca de huevo. Uno de estos conocidos agentes de inmovilización más ampliamente usado es la poli-1-lisina (PLL) .

La PLL es un gran homopolímero policatiónico que muestran una fuerte carga positiva producida por los grupos amino terminales de las cadenas laterales residuales de lisina a lo largo de todo el polímero. La L-lisina [ácido (S) 2, 6-diaminohexanoico] es un aminoácido con la estructura química mostrada continuación en la fórmula (1) . PEI y col. (Biomac Romolecules 2001, 2, páginas 463 -468) describen capas de ADN-PDDA en una superficie.

El polímero de PLL es una cadena de unidades monoméricas de 1-lisina unidas mediante enlaces peptídicos. La estructura química de la PLL se proporciona a continuación en la fórmula (2) , donde n es un número entero que 40 representa el número de unidades monoméricas de la cadena polimérica.

Aunque la PLL se usa ampliamente como un recubrimiento polimérico policatiónico, los sustratos recubiertos con 45 PLL tienden a perder su eficacia de inmovilización en un periodo de tiempo relativamente corto. Se cree que esta disminución de la eficacia con el tiempo es debida a la oxidación de los grupos amino de las cadenas laterales de la PLL. Los grupos oxidados no muestran la carga neta positiva requerida para la adecuada adhesión de los materiales biológicos que se quieren inmovilizar.

La eficacia de la PLL como agente de inmovilización también está limitada por su inherente estructura química, mostrada anteriormente en la fórmula (2) . Según se mencionó anteriormente, los residuos de aminoácidos del polímero están conectados mediante enlaces peptídicos (enlaces de -CO-NH-) . Estos enlaces peptídicos son altamente vulnerables a la escisión por enzimas proteolíticas, tales como tripsina, y a escisiones hidrolíticas en

general, tales como a través del ataque procedente de una sustancia nucleófila. La escisión de los enlaces peptídicos da como resultado moléculas de PLL con una longitud de cadena sustancialmente más corta, medida mediante el peso molecular medio del polímero. Dado que el peso molecular de la molécula de PLL se reduce debido a la escisión proteolítica, la capacidad de inmovilización de la molécula (es decir, su propiedad adhesiva) queda reducida en gran medida.

Algunos agentes de inmovilización conocidos, tales como la PLL, muestran una utilidad limitada como resultado de las inestabilidades químicas descritas anteriormente. Consecuentemente, los sustratos recubiertos con los agentes conocidos también muestran una utilidad limitada, particularmente durante su uso a largo plazo o su uso después de un tiempo de almacenamiento significativo. Dada la estabilidad limitada de los sustratos recubiertos con los agentes de inmovilización conocidos, sería muy útil tener un sustrato prerrecubierto que esté recubierto con un agente de inmovilización que muestre una estabilidad aumentada, siendo particularmente útil para inmovilizar una muestra biológica para su observación.

Resumen de la invención La invención son está limitada por las reivindicaciones.

La presente invención proporciona un sustrato recubierto adaptado preferentemente para inmovilizar una muestra biológica. El sustrato se recubre con un polímero policatiónico que muestra una estabilidad aumentada en comparación con las agentes de inmovilización conocidos previamente en la técnica. Consecuentemente, el sustrato recubierto con el polímero policatiónico estable es útil para inmovilizar muestras biológicas con una carga neta negativa, y el sustrato recubierto mantiene dicha utilidad durante un periodo prolongado de tiempo.

En una forma de realización de la presente invención, se proporciona un procedimiento para preparar un sustrato recubierto. Preferentemente, el sustrato recubierto está adaptado para inmovilizar una muestra biológica. Según una forma de realización, el procedimiento comprende proporcionar un sustrato con una superficie que comprende una pluralidad de grupos aniónicos, y poner en contacto el sustrato con una composición que comprende una disolución de un material polimérico no peptídico para formar un recubrimiento del material polimérico no peptídico en al menos una porción de la superficie del sustrato. La disolución que comprende el material polimérico no peptídico puede ser

una disolución acuosa o una disolución orgánica, preferiblemente con un pH de al menos aproximadamente 6.

En una forma de realización preferida de la invención, el procedimiento comprende adicionalmente las etapas de secar el sustrato recubierto con el material polimérico no peptídico. Preferentemente, el sustrato recubierto con el material polimérico no peptídico seco en el mismo se enjuaga.

En otra forma de realización preferida de la invención, el procedimiento está caracterizado por la ausencia de limpieza del sustrato. En particular, el procedimiento excluye someter al sustrato a un proceso de limpieza antes de poner en contacto el sustrato con el material polimérico no peptídico.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un sustrato prerrecubierto, tal como un portaobjetos para microscopio, que está adaptado preferentemente para la inmovilización de una muestra biológica para su análisis. Según una forma de realización, el sustrato comprende una superficie con una pluralidad de grupos aniónicos para proporcionar una carga neta negativa, y el sustrato está recubierto con un material polimérico no peptídico que comprende una pluralidad de grupos catiónicos.

El sustrato prerrecubierto, según este aspecto de la invención, está caracterizado por su capacidad de movilizar un número medio de células por área superficial del sustrato. En una forma de realización en particular, el sustrato prerrecubierto es capaz de inmovilizar un número medio de células por área superficial de al menos aproximadamente 20.000 células/cm2 cuando el sustrato prerrecubierto se pone en contacto con 1 ml de una 55 suspensión de células procedentes de la línea celular SiHa.

Según otra forma de realización de la invención, el material polimérico no peptídico usado para el recubrimiento del sustrato prerrecubierto comprende un polímero alílico, un polímero vinílico o una combinación de los mismos, comprendiendo preferentemente grupos catiónicos elegidos del grupo que consiste en aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias y aminas cuaternarias. En una forma de realización preferida, el material polimérico no peptídico comprende polidialildimetilamonio (PDDA) . En otra forma de realización preferida de la invención, el material polimérico no peptídico comprende polialilamina (PAH) .

El sustrato según la presente invención puede ser cualquier artículo o aparato útil o necesario para observar o 65... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar un sustrato recubierto adaptado para inmovilizar una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento:

proporcionar un sustrato con una superficie que comprende una pluralidad de grupos aniónicos; poner en contacto el sustrato con una composición que comprende una disolución de un material polimérico catiónico no peptídico, teniendo la disolución un pH de 8 a 14, para formar un recubrimiento del material polimérico no peptídico en al menos una porción de la superficie del sustrato;

secar el recubrimiento del material polimérico no peptídico; y aclarar el sustrato con el recubrimiento del material polimérico no peptídico seco sobre el mismo, donde el recubrimiento del material polimérico no peptídico esta posicionado para inmovilizar una muestra biológica.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, donde el procedimiento comprende formar un recubrimiento de una única capa del material polimérico no peptídico sin ninguna capa intermedia de un material de recubrimiento diferente entre dos o más capas del material de recubrimiento polimérico no peptídico.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, donde dicha etapa de secado del sustrato recubierto se lleva a cabo a temperatura ambiente, o a una temperatura de 35ºC a 120ºC; o donde dicha etapa de secado del sustrato recubierto 20 se lleva a cabo durante un periodo de tiempo de desde aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 1 hora.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, donde dicha etapa de secado del sustrato recubierto se lleva a cabo a una temperatura de 35ºC a 120ºC; y durante un periodo de tiempo de 1 minuto a 20 minutos.

5. El procedimiento según la reivindicación 1, donde el sustrato se elige de entre portaobjetos, placas, microesferas, tubos de ensayo, cubetas, tiras reactivas, hisopos y gasa; o donde el sustrato es un portaobjetos de microscopio.

6. El procedimiento según la reivindicación 5, donde el portaobjetos comprende un material elegido de entre vidrio,

cerámica y materiales poliméricos. 30

7. El procedimiento según la reivindicación 6, donde el portaobjetos comprende un polímero elegido de entre poliestireno, polihidroximetacrilato, tereftalato de polietileno, politetrafluoroetileno, etileno fluorado, polidimetilsiloxano, copolímeros o terpolímeros de los mismos, y combinaciones de los mismos.

8. El procedimiento según la reivindicación 1, donde el material polimérico no peptídico comprende al menos un monómero elegido de entre dialildimetilamonio, alilamina, metilacrilamidopropiltrimetilamonio, acrilamida, ácido acrílico, metacriloiloxietiltrimetilamonio, 4-vinil-benciltrimetilamonio, ácido metacrílico, acrilato de hidroxietilo, metacrilato, metacrilato de metilo, metacrilato de hidroxietilo, 4-vinilpiridinio, 4-vinil-1-metilpiridinio, acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de butilo, acrilato de 2-etil hexilo, acrilato de dimetilaminoetilo, cloruro cuaternario de

dimetilaminoetilacrilato de metilo, dimetilaminopropilacrilamida, dimetilaminopropilacrilamida cloruro de metilo cuaternario, acriloxietildimetilbencilamonio, acriloxietiltrimetilamonio, metacrilato de dimetilaminoetilo, metacriloxietildimetilamonio, metacriloxietiltrimetilbencilamonio, eteno, etilenoimina, propeno, estireno, cloruro de vinilo, isobutileno, trimetil-2-metacriloiletilamonio, trimetil-2-metacrilaminopropilamonio, y mezclas de los mismos.

9. El procedimiento según la reivindicación 1, donde el material polimérico no peptídico comprende un polímero elegido de entre polímeros alílicos, polímeros vinílicos y mezclas de los mismos.

10. El procedimiento según la reivindicación 1, donde el material polimérico no peptídico comprende polidialildimetilamonio, polialilamina o un copolímero de dialildimetilamonio y al menos un monómero adicional. 50

11. El procedimiento según la reivindicación 1, donde el material de recubrimiento polimérico no peptídico está presente en disolución a una concentración del 0, 01% (p/v) al 10% (p/v) o del 0, 15% (p/v) al 0, 75% (p/v) ; o donde el material de recubrimiento polimérico no peptídico tiene un peso molecular medio de al menos 75.000 Da o de 400.000 Da a 500.000 Da. 55

12. El procedimiento según la reivindicación 1, donde la superficie del sustrato no ha sido sometida a un proceso de limpieza previo al contacto del sustrato con la disolución del material polimérico no peptídico.

13. El procedimiento según la reivindicación 12, donde la superficie del sustrato no ha sido sometida a un proceso

de limpieza que incorpora un ácido, una base o un disolvente orgánico previo al contacto del sustrato con la disolución del material polimérico no peptídico.

14. El procedimiento según la reivindicación 1, donde la superficie del sustrato no ha sido sometida a un proceso de silanización previo al contacto del sustrato con la disolución del material polimérico no peptídico. 65

15. Un sustrato prerrecubierto preparado según el procedimiento de la reivindicación 1.

16. Un sustrato prerrecubierto, preparado según la reivindicación 1, adaptado para la inmovilización de una muestra biológica para su análisis, comprendiendo el sustrato una superficie con una pluralidad de grupos aniónicos, donde 5 el sustrato está recubierto con una única capa de un material polimérico no peptídico que comprende una pluralidad de grupos catiónicos sin la intervención de capas intermedias de un material de recubrimiento diferente entre dos o más capas del material de recubrimiento polimérico no peptídico, y donde la superficie del sustrato prerrecubierto es capaz de inmovilizar un número medio de células por área superficial de al menos aproximadamente 20.000 células/cm2 cuando el sustrato prerrecubierto se pone en contacto con 1 ml de una suspensión de células procedentes de la línea celular SiHa.

17. El sustrato prerrecubierto según la reivindicación 16, donde la superficie del sustrato prerrecubierto es capaz de inmovilizar un número medio de células por área superficial de al menos aproximadamente 22.000 células/cm2 o de al menos aproximadamente 23.000 células/cm2 cuando el sustrato prerrecubierto se pone en contacto con 1 ml de una suspensión de células procedentes de la línea celular SiHa.

18. El sustrato prerrecubierto según la reivindicación 16, donde el sustrato es un sustrato según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

19. El sustrato prerrecubierto según la reivindicación 18, donde el sustrato es un portaobjetos de microscopio y el material polimérico no peptídico es un material polimérico no peptídico según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

20. El sustrato prerrecubierto según la reivindicación 18, donde el sustrato es un portaobjetos de microscopio y el

material polimérico no peptídico recubierto sobre el portaobjetos tiene un espesor de capa de 0, 005 !m a 500 !m, o un espesor de capa de 1 !m a 50 !m.

21. El sustrato prerrecubierto según la reivindicación 16, donde el material polimérico no peptídico tiene un peso molecular medio de al menos aproximadamente 75.000 Da, o de desde aproximadamente 400.000 Da hasta 30 aproximadamente 500.000 Da.

22. El sustrato prerrecubierto según la reivindicación 18, donde el sustrato es un portaobjetos de microscopio y el portaobjetos está particularmente adaptado para la inmovilización para el análisis de una muestra biológica elegida del grupo que consiste en una muestra de ADN, una muestra de un polipéptido, una muestra de fluido, una muestra celular, una muestra de un nucleótido, una micromatriz de tejido, una micromatriz citológica y una micromatriz de ácidos nucleicos.

23. El sustrato prerrecubierto según la reivindicación 16, donde el material polimérico no peptídico recubierto sobre el sustrato se aplica al sustrato como una disolución, donde el material polimérico no peptídico está presente a una 40 concentración del 0, 01% (p/v) al 10% (p/v) o del 0, 15% (p/v) al 0, 75% (p/v) .

24. Un procedimiento para analizar una muestra biológica que comprende:

proporcionar un sustrato prerrecubierto de la reivindicación 15 ó 16;

aplicar una muestra biológica al sustrato prerrecubierto para inmovilizar la muestra biológica en el sustrato; y analizar la muestra biológica inmovilizada en el sustrato prerrecubierto.

25. El procedimiento según la reivindicación 24, donde dicha etapa de análisis comprende el uso de un instrumento diagnóstico elegido del grupo que consiste en microscopios, cromatógrafos, espectrómetros y dispositivos de 50 imagen.

26. El procedimiento según la reivindicación 24, donde la muestra biológica se elige de entre células, tejido, fluidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos, oligonucleótidos, polipéptidos y proteínas.

27. El procedimiento según la reivindicación 24, donde el sustrato está adaptado para la inmovilización para su análisis de una muestra biológica elegida de entre una muestra de ADN, una muestra de un polipéptido, una muestra de fluido, una muestra celular, una muestra de un nucleótido, una micromatriz de tejido, una micromatriz citológica y una micromatriz de ácidos nucleicos.

28. El procedimiento según la reivindicación 24, donde el material polimérico no peptídico recubierto sobre el sustrato se aplica al sustrato como una disolución, donde el material polimérico no peptídico está presente a una concentración del 0, 01% (p/v) al 10% (p/v) o del 0, 15% (p/v) al 0, 75% (p/v) .