Anticuerpos humanizados que secuestran el péptido amiloide beta.

Anticuerpo humanizado que liga específicamente un epítopo contenido en las posiciones 13-28 de A.

Anticuerpos humanizados que secuestran el péptido amiloide beta.

Campo técnico

La presente invención se refiere a anticuerpos humanizados que se unen a un epítopo entre los aminoácidos 13 y 28 del péptido Aß y para el tratamiento preventivo y terapéutico de las enfermedades relacionadas con el amiloide beta, tales como la enfermedad de Alzheimer, el síndrome de Down y la angiopatía amiloide cerebral. Se refiere más específicamente, al uso de anticuerpos monoclonales humanizados para secuestrar el péptido amiloide beta (Aß) en el plasma, cerebro y fluido cerebroespinal para impedir la acumulación o para invertir la deposición del péptido Aß en el cerebro y en los vasos sanguíneos del cerebro y para mejorar el conocimiento.

Técnica anterior

Numerosas sintomatologías que producen insuficiencias cognitivas, apoplejía, hemorragia cerebral y debilitamiento mental general parece que están relacionadas con las placas neuríticas y cerebrovasculares en el cerebro que contiene el péptido amiloide beta (Aß) . Entre estas enfermedades están tanto el cuadro preclínico como el clínico de Alzheimer, el síndrome de Down, y la angiopatía preclínica y clínica amiloide cerebral (CAA) . Las placas amiloides están formadas por péptidos amiloides beta. Estos péptidos circulan en la sangre y en el fluido cerebroespinal (CSF) , normalmente en forma acomplejada con lipoproteínas. El péptido Aß en forma circulante se compone de 39 a 43 aminoácidos (normalmente 40 ó 42 aminoácidos) procedentes de la escisión de una proteína precursora común, una proteína precursora amiloide, con frecuencia denominada APP. Algunas formas de Aß soluble son ellas mismas neurotóxicas y pueden determinar la gravedad de la neurodegeneración y/o la disminución del conocimiento (McLean, C.A., et al., Ann. Neurol. (1999) 46:860-866; Lambert, M.P., et al., (1998) 95:6448-6453; Naslund, J., J. Am. Med. Assoc. (2000) 283:1571) .

La prueba sugiere que Aß se puede volver a transportar y así sucesivamente entre el cerebro y la sangre (Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67:880-883; Zlokovic, B.V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040; Shibata M, et al., J. Clin. Invest. (2000) 106 :1489-1499) . Además Aß en las placas está en equilibrio con Aß soluble en el cerebro y en la sangre (Kawarabayashi T, et al., J. Neurosci. (2001) 21:372-381) .

Tal como se describe en la solicitud de PCT US00/35681 y en el documento U.S. n° de serie 09/153.130 incorporados ambos en esta memoria por referencia, las concentraciones circulantes totales del péptido Aß en el CSF son similares en individuos normales y en individuos predispuestos a presentar los síntomas de Alzheimer. Sin embargo, las concentraciones de Aß42 son menores por término medio en individuos con enfermedad de Alzheimer (Nitsch, R.M., et al., Ann. Neurol. (1995) 37:512-518) . Es conocido que Aß42 es más propenso a acumularse que Aß40 y cuando esto sucede, surgen consecuencias desfavorables tales como la deposición de Aß en las placas amiloides, la transformación de Aß en formas tóxicas solubles, la alteración de las células nerviosas y el trastorno del comportamiento tal como la demencia (Golde, T.E., et al., Biochem. Biophys. Acta. (2000) 1502:172-187) .

Los procedimientos para provocar una respuesta inmunitaria para reducir los depósitos amiloides se describen en la publicación PCT WO99/27944 publicada el 10 de junio de 1999. La descripción supone que el péptido Aß acumulado completo resultaría un inmunógeno útil. La administración de un fragmento Aß (aminoácidos 13 a 28) conjugado con IgG anti-ratón de oveja no produjo cambio en la carga amiloide de la corteza cerebral y únicamente uno entre nueve animales que recibieron inyecciones del conjugado del fragmento 13 a 28 de Aß presentó alguna linfoproliferación en respuesta a Aß40. La solicitud también indica que se podrían utilizar los anticuerpos que se unen de forma especifica al péptido Aß como agentes terapéuticos. Sin embargo, parece que esto es una especulación ya que los datos que lo apoyan reflejan los protocolos que implican el uso de la inmunización activa, por ejemplo, Aß42. Los péptidos se suministran utilizando adyuvantes y se determinan los títulos de anticuerpo formados en la inmunización, así como las concentraciones de péptido Aß y del péptido precursor. La publicación sugiere claramente que la placa Aß debe reducirse para aliviar los síntomas de Alzheimer y que se necesitan los procesos mediados por las células para la reducción con éxito de la placa Aß.

El documento WO 99/60024, publicado el 25 de noviembre de 1999, se refiere a los procedimientos para la eliminación de amiloides utilizando anticuerpos antiamiloides. El mecanismo, sin embargo, está indicado para utilizar la capacidad de los anticuerpos anti-Aß para unirse a los depósitos amiloides preformados (es decir, placas) y produce la eliminación microglial local posterior de placas localizadas. Este mecanismo no se ensayó in vivo. Esta publicación indica además que para ser eficaz entre las placas Aß, los anticuerpos anti-Aß deben conseguir entrar en el parénquima cerebral y a través de la barrera sangre-cerebro.

El 7 de diciembre de 2000 se publicaron varias solicitudes PCT que se refieren a intentos para controlar las placas amiloides. El documento WO 00/72880 describe la reducción significativa en las placas en la corteza cerebral y el hipocampo en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Alzheimer cuando se trata utilizando fragmentos N-terminales de péptido Aß y anticuerpos que se unen a ellos, pero no cuando se trata con el fragmento 13 a 28 de Aß conjugado con IgG anti-ratón de oveja o con un anticuerpo contra el fragmento 13 a 28, del anticuerpo 266. Los anticuerpos dirigidos N-terminales se impusieron para cruzar la barrera sangre-cerebro y para provocar fagocitosis de las placas amiloides en estudios in vitro.

El documento WO 00/72876 tiene prácticamente la misma descripción que el documento WO 00/72880 y se refiere a la inmunización con los propios componentes de la fibrilla amiloide.

El documento WO 00/77178 describe anticuerpos que se diseñaron para catalizar la hidrólisis del ß-amiloide, incluyendo los anticuerpos obtenidos contra una mezcla de los compuestos de transición de fenilalanina estatina CysAßio10-25, estatina Phe19-Phe20 y Cys-Aß10-25 estatina Phe20-Ala21 y anticuerpos obtenidos contra Aß10-25 que tienen un enlace amida reducido entre Phe19 y Phe20. Este documento menciona el secuestro de Aß, pero esto es una suposición porque no da pruebas de dicho secuestro. Además, el documento no proporciona pruebas in vivo de que la administración de anticuerpos produzca la salida de Aß del sistema nervioso central, interfiera con la formación de placas, reduzca la carga de placa, forme complejos entre los anticuerpos y Aß en las muestras de tejido o afecte al conocimiento.

Se ha demostrado que una vía para el metabolismo de Aß es la vía de transporte desde el SNC al plasma (Zloko- vic, B.V., et al., Proc. Natt. Acad. Sci (USA) (1996) 93:4229-4234; Ghersi-Egea, J-F, et al., J. Neurochem. (1996) 67 :880-883) . Además, se ha demostrado que Aß en el plasma puede atravesar la barrera sangre-cerebro y entrar en el cerebro (Zlokovic, B. V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040) . Se ha demostrado también que la administración de determinados anticuerpos Aß policlonales y monoclonales disminuye la deposición de Aß en las placas amiloides en el modelo de ratón transgénico APPV717F de la enfermedad de Alzheimer (Bard, F., et al., Nature Med. (2000) 6:916-919) ; sin embargo, se dijo que esto es debido a determinados anticuerpos anti-Aß que atraviesan la barrera sangre-cerebro estimulando la fagocitosis de las placas amiloides por las células microgliales. En los experimentos de Bard, los análisis de secciones de cerebro ex vivo demostraron que la presencia de anticuerpo Aß añadido, junto con la microglia añadida exógenamente, produjo fagocitosis de Aß, dando como resultado la eliminación de los depósitos de Aß.

Los niveles tanto de Aß40 soluble como de Aß42 en el CSF y en la sangre se pueden detectar fácilmente utilizando análisis normalizados que utilizan anticuerpos dirigidos contra epítopos a lo largo de la cadena Aß. Dichos análisis han sido descritos, por ejemplo, en las patentes U.S. n° 5.766.846; n° 5.837.672 y n° 5.593.846. Estas patentes describen la producción de anticuerpos monoclonales murinos en el dominio central del péptido Aß y se describió que éstas tienen epítopos alrededor e incluyendo las posiciones 16 y 17. Se describieron también los anticuerpos dirigidos contra la zona N-terminal. Se impusieron varios anticuerpos monoclonales...

1. Un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo, que comprende:

a. una cadena ligera que comprende tres zonas determinantes de complementariedad (CDR) de cadena ligera con las secuencias de aminoácidos siguientes: cadena ligera CDR1:

(SEC. ID N.°: 1)

o

(SEC. ID N.°: 15) cadena ligera CDR2:

y cadena ligera CDR3:

y una secuencia con estructura de cadena ligera de una cadena ligera de inmunoglobulina humana; y

b. una cadena pesada que comprende tres CDR de cadena pesada que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

cadena pesada CDR1:

(SEC. ID n.°: 4)

cadena pesada CDR2:

(SEC. ID N.°: 5)

o (SEC. ID N.°: 16) y cadena pesada CDR3:

(SEC. ID N.°: 6) .

y una secuencia con estructura de cadena pesada de una cadena pesada de inmunoglobulina humana; en la que el anticuerpo o fragmento une específicamente un epítopo que contiene las posiciones 13 a 28 de Aß.

2. Anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de la reivindicación 1, en el que la cadena CDR1 es:

(SEC. ID N.°: 1) y cadena pesada CDR2:

(SEC. ID N.°: 5)

3. Anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de la reivindicación 1, que comprende una zona variable de cadena ligera humanizada que comprende la siguiente secuencia:

(SEC. ID N.°: 7) en la que:

Xaa en la posición 2 es Val ó Ile; Xaa en la posición 7 es Ser ó Thr; Xaa en la posición 14 es Thr ó Ser; Xaa en la posición 15 es Leu ó Pro; Xaa en la posición 30 es Ile ó Val;

Xaa en la posición 50 es Arg, Gln ó Lys; Xaa en la posición 88 es Val ó Leu; Xaa en la posición 105 es Gln ó Gly; Xaa en la posición 108 es Lys ó Arg; y

Xaa en la posición 109 es Val ó Leu. y una zona variable de cadena pesada que comprende la siguiente secuencia:

(SEC. ID N.°: 8)

en la que:

Xaa en la posición 1 es Glu ó Gln;

Xaa en la posición 7 es Ser ó Leu;

Xaa en la posición 46 es Glu, Val, Asp ó Ser; 10 Xaa en la posición 63 es Thr ó Ser;

Xaa en la posición 75 es Ala, Ser, Val ó Thr;

Xaa en la posición 76 es Lys ó Arg;

Xaa en la posición 89 es Glu ó Asp;

Xaa en la posición 107 es Leu ó Thr.

4. Anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de la reivindicación 1, que presenta una zona variable de cadena ligera de la secuencia determinada por la SEC ID n°: 9 y una zona variable de cadena pesada determinada por la SEC ID N.°: 10.

5. Anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de la reivindicación 4, que presenta una cadena ligera de la secuencia determinada por la SEC ID N.°: 11 y una cadena pesada de la secuencia determinada por la SEC ID N.°: 12.

6. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 5.

7. Anticuerpo humanizado o fragmento de la reivindicación 1 que es un isótopo de la inmunoglobulina IgG1.

8. Anticuerpo humanizado o fragmento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se produce en una célula huésped seleccionada de entre el grupo que cosiste en una célula de mieloma, una célula de ovario de hámster chino, una célula de ovario de hámster sirio, y una célula de riñón embrionario humano.

9. Un acido polinucleico que comprende una secuencia codificadora para la cadena ligera o la cadena pesada del anticuerpo humanizado o fragmento de la reivindicación 1.

10. Ácido polinucleico de la reivindicación 9, que comprende una secuencia codificadora para la zona variable de la cadena ligera dada por la SEC ID N.°: 7 o la SEC ID N.°: 9.

11. Ácido polinucleico de la reivindicación 9, que comprende una secuencia codificadora para la zona variable de la cadena pesada dada por la SEC ID N.°: 8 o la SEC ID N.°: 10.

12. Ácido polinucleico de la reivindicación 9, que comprende una secuencia codificadora para la cadena ligera dada por la SEC ID N.°: 11.

13. Ácido polinucleico la reivindicación 9, que comprende una secuencia codificadora para la cadena pesada dada por la SEC ID N.°: 12.

14. Ácido polinucleico que comprende una secuencia codificadora para la cadena ligera o la cadena pesada del anticuerpo humanizado o fragmento de la reivindicación 5.

15. Ácido polinucleico, que cuando se expresa en una célula huésped adecuada, da el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1.

16. Ácido polinucleico, que cuando se expresa en una célula huésped adecuada, da el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 5.

17. Un vector de expresión para expresar el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1, que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican dicho anticuerpo o fragmento.

18. Una célula transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 17.

19. Célula transfectada con dos vectores de expresión de la reivindicación 17, en la que un primer vector comprende la secuencia de polinucleótido que codifica para la cadena ligera y un segundo vector comprende la secuencia que codifica para la cadena pesada.

20. Un vector de expresión para expresar el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 5, que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican dicho anticuerpo o fragmento.

21. Una célula transfectada con el vector de expresión dela reivindicación 20.

22. Célula transfectada con dos vectores de expresión de la reivindicación 20, en la que un primer vector comprende la secuencia de polinucleótido que codifica para la cadena ligera y un segundo vector comprende la secuencia que codifica para la cadena pesada.

23. Célula que puede expresar el anticuerpo humanizado o fragmento de la misma de la reivindicación 1 o la reivindicación 5.

24. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 5 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

25. Uso del anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 5, para la fabricación de un medicamento, para el tratamiento clínico o preclínico de la enfermedad de Alzheimer, del síndrome de Down o de la angiopatía amiloide cerebral clínica o preclínica.

26. Uso de un anticuerpo humanizado o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 5, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento, la prevención o la reducción cognitiva inversa en la enfermedad de Alzheimer clínica o preclínica, síndrome de Down o la angiopatía amiloide cerebral clínica o preclínica.

27. Uso del anticuerpo humanizado o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 5, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

FIGURA 1 FIGURA 2 FIGURA 3

Figura 4. Secuencias de polinucleótidos de pVk-Hu266 para expresar la cadena ligera de 266 humanizado y códigos de un solo aminoácido para la cadena ligera de 266 humanizada expresada La secuencia completa del gen de la cadena ligera de Hu266 está localizada entre los puntos Mlul y BamHI en pVk-Hu266. El número de nucleótido indica su posición en pVk-Hu266. Los exones Vk y Ck se traducen por un código de una sola letra; el punto indica el codón de terminación de la traducción. La cadena pesada madura comienza en el ácido aspártico (D) con subrayado doble. Las secuencias del intrón están en cursiva.

Figura 5. Secuencias de polinucleótidos de pVg1-Hu266 para expresar la cadena pesada de 266 humanizado y códigos de un solo aminoácido para la cadena pesada de 266 humanizada expresada.

La secuencia completa del gen de la cadena pesada de Hu266 está localizada entre los puntos Mlul y BamHI en pVg1-Hu266. El número de nucleótido indica su posición en pVg1-Hu266. Los exones VH y CH se traducen por un código de una sola letra. El punto indica el codón de terminación de la traducción. La cadena pesada madura comienza en el ácido glutámico (E) con subrayado doble. Las secuencias del intrón están en cursiva.

Figura 6. Plásmido pVkHu266 Figura 7. Plásmido pVg1-Hu266