Anticuerpos estables y solubles que inhiben TNFalfa.

Un anticuerpo o derivado de anticuerpo estable y soluble que se une específicamente a TNFa,

comprendiendo dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo un dominio variable de cadena ligera (VL) deSEO ID NO: 1 que se combina con el dominio variable de cadena pesada (VH) de SEO ID NO: 2.

Anticuerpos estables y solubles que inhiben TNFa

Campo técnico

La presente invención se refiere a anticuerpos y derivados de anticuerpos optimizados que se unen a y bloquean la función del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) y son útiles para el diagnóstico y/o el tratamiento, la prevención o la mejora de enfemnedades asociadas a TNFa; a sus secuencias codificantes, producción y uso en composiciones farmacológicamente adecuadas.

Antecedentes de la técnica El factor de necrosis tumoral alfa (TNFa, también conocido como caquectina) , es una citocina de mamiferos que se produce de manera natural por numerosos tipos de células, incluyendo monocitos y macrófagos en respuesta a endotoxina u otros estímulos. TNFa es un mediador principal de reacciones inflamatorias, inmunológicas y

fisiopatológicas (Grell, M., et al. (1995) Cell, 83: 793-802) .

Se forma TNFa soluble mediante la escisión de una proteína transmembrana precursora (Kriegler, et al. (1988) Cell

53: 45-53) , y los polipéptidos de 17 kDa secretados se ensamblan para formar complejos de homotrímero solubles (Smith, et al. (1987) , J. Biol. Chem. 262: 6951-6954; para revisiones de TNF, véase Butler, et al. (1986) , Nature 320:584; Old (1986) , Science 230: 630) . Estos complejos se unen entonces a receptores que se encuentran en una variedad de células. La unión produce una serie de efectos proinflamatorios, incluyendo (i) liberación de otras citocinas proinflamatorias tales como interleucina (IL) -6, IL-8 e IL-1, (ii) liberación de metaloproteinasas de la matriz y

(iii) regulación por incremento de la expresión de moléculas de adhesión endotelial, que amplifican adicionalmente la cascada inflamatoria e inmunitaria atrayendo leucocitos a tejidos extravasculares.

Un gran número de trastornos están asociados con niveles elevados de TNFa, muchos de ellos de importancia médica significativa. Se ha mostrado que el TNFa está regulado por incremento en varias enfemnedades humanas, incluyendo enfermedades crónicas tales como artritis reumatoide (AR) , trastornos inflamatorios del intestino incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, septicemia, insuficiencia cardiaca congestiva, asma bronquial y

esclerosis múltiple. Ratones transgénicos para TNFa humano producen altos niveles de TNFa. de manera constitutiva y desarrollan una poli artritis espontánea, destructiva que se asemeja a la AR (Keffer et al. 1991, EMBO J., 10, 4025-4031) . Por tanto, se considera que el TNFa es una citocina proinflamatoria.

Está bien establecido ahora que el TNFa es clave en la patogénesis de AR, que es una enfermedad crónica, progresiva y debilitante caracterizada por inflamación y destrucción de articulaciones poliarticulares, con síntomas sistémicos de fiebre y malestar y fatiga. La AR también conduce a inflamación sinovial crónica, con frecuente progresión hasta destrucción de hueso y cartílago articular. Se encuentran niveles aumentados de TNFa tanto en el

líquido sinovial como en la sangre periférica de pacientes que padecen AA. Cuando se administran agentes bloqueantes de TNFa a pacientes que padecen AR, reducen la inflamación, mejoran los síntomas y retardan el daño articular (McKown et al. (1999) , Arthritis Rheum. 42:1204-1208) .

Fisiológicamente, el TNFa está asociado también con protección frente a infecciones particulares (Cerami. et al. (1988) , Immunol. Today 9:28) . Se libera TNFa por macrófagos que se han activado mediante lipopolisacáridos de bacterias Gram-negativas. Como tal, parece que el TNFa es un mediador endógeno de importanCia central implicado en el desarrollo y la patogénesis del choque endotóxico asociado con septicemia bacteriana (Michie, et al. (1989) , Br. J. Surg.76:670-671; Debets. et al. (1989) , Second Vienna Shock Forum, p. 463-466; Simpson, et al. (1989) Crit. Care Clin. 5: 27-47; Waage et al. (1987) . Lancet 1: 355-357; Hammerle. et al. (1989) Second Vienna Shock Forum p. 715-718; Debets. etal. (1989) , Crit. Care Med. 17:489-497; Calandra. etal. (1990) , J. Infect. Dis. 161 :982-987; Revhaug et al. (1988) , Arch. Surg. 123:162-170) .

Como con otros sistemas orgánicos, se ha mostrado también que el TNFa desempeña un papel clave en el sistema nervioso central, en particular en trastornos inflamatorios y autoinmunitarios del sistema nervioso, incluyendo esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barre y miastenia grave, y en trastornos degenerativos del sistema nervioso, incluyendo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfemnedad de Huntington. El TNFa está implicado también en trastornos de sistemas relacionados de la retina y del músculo, incluyendo neuritis óptica,

degeneración macular, retinopatía diabética, dermatomiositis, esclerosis lateral amiotrófica y distrofia muscular, así como en lesiones del sistema nervioso, incluyendo lesión cerebral traumática, lesión aguda de la médula espinal y accidente cerebrovascular.

La hepatitis es otro trastorno inflamatorio relacionado con TNFa. que entre otros desencadenantes puede estar

provocada por infecciones virales, incluyendo virus de Epstein-Barr, citomegalovirus y de la hepatitis A-E. La hepatitis provoca inflamación aguda del hígado en la región portal y lobular, seguido por fibrosis y progresión tumoral.

El TNFa puede mediar en la caquexia en cáncer, que provoca la mayoría de la morbilidad y mortalidad del cáncer (Tisdale M.J. (2004) , Langenbecks Arch Surg. 389:299-305) .

El papel clave desempeñado por el TNFa en inflamación, respuestas inmunitarias celulares y la patología de muchas enfermedades ha conducido a la búsqueda de antagonistas de TNFa.

El TNFa es una citocina importante cuyo bloqueo sistémico conlleva el riesgo de un aumento de la frecuencia y gravedad de infecciones manifestadas clínicamente, en particular reactivación de tuberculosis latente y posiblemente otros riesgos incluyendo inducción de linfomas, enfermedades desmielinizantes e insuficiencia cardiaca.

Una clase de antagonistas de TNFa diseñados para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNFa son anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se unen especificamente a TNFa y bloquean de ese modo su función. El uso de anticuerpos anti-TNFa ha mostrado que un bloqueo de TNFa puede revertir efectos atribuidos a TNFa incluyendo disminuciones en IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, moléculas de adhesión y destrucción de tejido (Feldmann el al. (1997) , Adv.lmmunol. 1997:283-350) .

Se han propuesto anticuerpos dirigidos contra TNFa para la profilaxis y el tratamiento de choque endotóxico (Beutler el al. (1985) Science: 234, 470-474) . El uso de anticuerpos anti-TNFa en el tratamiento del choque septicémico se discute por Bodmer el al., 1993, (Critical Care Medicine, 21:441-946, 1993) , Wherr y el al., 1993, (Critical Care Medicine, 21 :436-440) y Kirschenbaum el al., 1998, (Critical Care Medicine, 26:1625-1626) .

Se ha dado a conocer un método para tratar una enfermedad neurodegenerativa en un ser humano administrando un anticuerpo monoclonal anti-TNFa o un fragmento de unión a TNFa del mismo en el documento US2003147891.

El documento W0014932 enseña el uso de bloqueantes de TNFa incluyendo anticuerpos anti-TNFa para tratar trastomos neurológicos y relacionados provocados por TNFa. Proporciona un método para tratar dichos trastornos administrando un antagonista de TNFa.

El documento W00304751 O da a conocer diversas clases de anticuerpos monoclonales y modificados por ingeniería genética dirigidos contra TNFa, su producción, compuestos que los comprenden y su uso en medicina.

Anticuerpos útiles para terapias de enfermedades mediadas por TNFa son habitualmente o bien anticuerpos monoclonales (Acm) producidos mediante tecnología de hibridoma a partir de una fuente natural, habitualmente un ratón, o bien anticuerpos modificados por ingeniería genética. Estos últimos corresponden o bien a anticuerpos que se producen de manera natural porque comprenden cadenas pesadas y ligeras de longitud completa, o bien a los fragmentos Fab que pueden generarse también a partir de anticuerpos naturales mediante escisión proteolítica, o bien a anticuerpos scFv de cadena sencilla en los que se unen fragmentos de las regiones de cadena pesada y ligera variables mediante un ligador peptídico.

Las cadenas tanto pesadas como ligeras de un anticuerpo comprenden dominios constantes y variables. Puesto que los anticuerpos no humanos son inmunogénicos, la cantidad de secuencias de tipo humano en un anticuerpo se aumenta a menudo en un denominado anticuerpo "híbrido·, que comprende regiones constantes de una IgG

humana, y regiones variables que coinciden con las secuencias de un anticuerpo animal, en la mayoría... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo o derivado de anticuerpo estable y soluble que se une específicamente a TNFa, comprendiendo dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo un dominio variable de cadena ligera (VL) de SEO ID NO: 1 que se combina con el dominio variable de cadena pesada (VH) de SEO ID NO: 2.

2. El derivado de anticuerpo según la reivindicación 1, que es un anticuerpo scFv, en el que los dominios VL y VH están conectados por un ligador.

3. El anticuerpo scFv según la reivindicación 2, que comprende una disposición de secuencia VL-ligador-VH.

4. El anticuerpo scFv según la reivindicación 2 ó 3, en el que elligador tiene la secuencia SEO ID NO: 10 o se

deriva de dicha secuencia.

5. El anticuerpo scFv según la reivindicación 4, en el que al menos una G de dicho ligador se cambia por un aminoácido más polar o cargado .

6. El derivado de anticuerpo según la reivindicación 1, que es un fragmento Fab en el que el dominio VL se fusiona con la región constante de una cadena kappa de Ig humana, el dominio VH se fusiona con el dominio eHl de una IgG humana y los dos polipéptidos de fusión se conectan mediante un puente disulfuro intercatenario.

7. El anticuerpo o derivado de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6. que está marcado o químicamente modificado.

8. Una secuencia de ADN que codifica el anticuerpo o derivado de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

9. Un vector de expresión o clonación que contiene la secuencia de ADN según la reivindicación 8.

10. Una célula huésped adecuada transformada con Un vector de expresión según la reivindicación 9.

. La célula huésped según la reivindicación 10, que es una célula de E. eoli, de levadura, vegetal, de insecto o de mamífero.

12. Un método para la producción de una molécula de anticuerpo o derivado de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que comp rende cultivar la célula huésped según las reivindicaciones 10 u 11 en condiciones que permiten la srntesis de dicha molécula de anticuerpo y recuperarla de dicho cultivo.

13. El anticuerpo o derivado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, como producto farmacéutico.

14. El anticuerpo o derivado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad relacionada con TNFa.

15. El anticuerpo o derivado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1~7, para su uso en un

método de tratamiento de una enfermedad relacionada con TNFa según la reivindicación 14, caracterizado porque la enfermedad relacionada con TNFa es osteoartritis, síndrome de ojo seco, uvertis, enfermedades inflamatorias que afectan a la piel, psoriasis o enfermedad inflamatoria del intestino.

16. El anticuerpo o derivado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1·7, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad relacionada con TNFa en el que el anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra localmente o por vía tópica.

17. El uso de un anticuerpo o derivado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para la producción de un medicamento para el tratamiento de o como diagnóstico in vitro para la detección de enfermedades asociadas a TNFa.

18. El uso según la reivindicación 17, en el que el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad

asociada a TNFa y en el que el anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra localmente o por vía tópica.

19. El uso según la reivindicación 17 Ó 18, en el que la enfermedad asociada a TNFa es osteoartritis, uveltis, enfermedad inflamatoria del intestino, srndrome de ojo seco, enfermedades inflamatorias que afectan a la piel o psoriasis.

20. Una composición de diagnóstico o terapéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las

reivindicaciones 1 -7 en combinación con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

21. Una preparaclon de combinación que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 junto con al menos un segundo compuesto.

22. La preparación de combinación según la reivindicación 21, en la que el segundo compuesto no es un anticuerpo específico para TNFa.

s 23. La preparación de combinación según la reivindicación 21 Ó 22, para su uso como medicamento.

24. El vector según la reivindicación 9, como producto farmacéutico para aplicaciones de terapia génica en seres humanos y/o en animales.

Figura 1

Anticuerpo ScFv

VL

VH

(G GGGS) -ligilld ....

. .

I I .

TB-A DIVMl'QS.88 LSASVGOaV'1' L~ImVVWfQQlU' OJtAn:LLlYS D-a DlVL'1'Q8I'S. LSA.IVQDIlVT L'f'CDSQaVa ImVVWfQQlU' aaa.l'IQ\tLIYS • • ~DlSLa • A

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QG..... ... .., .

n-A M------DA MDnIIGIQG 'l'LV'J"YS8 T8-. M------DA MDDIIaQG 'l'LWY$S Tn.I) !'W Y • *

Figura 2

dominio VL e..

Enlace 50S

dominio VH eH'

Figura 3

Rendimiento de producción de scFv mediante expresión en Ecol;

A.

IPrG .. . .. • .. . + ., ., , 0 + . + .. ..

l. l. i I!.

ID

.... i •.... I!

= -...., ---

-

8.

Monómero

Agregados eo

Volumen de elución (mi)

Figura 4

Comparación de afinidad mediante ELlSA

A.

~TII..t. --O Tll-AB

-... T8~lAI 0, 8 -. () T1I-IIA

...... , ...

0, _

10 100 1000 10000

l~nM

B.

abe. 4!Onm

• TB-A

• TS-A H70J12

• T8-AL65

o •

0, 01 O, , 1 10 lOO 1000 [lIeFV] ntoe

Figura 5 Inhibición de citotoxicidad inducida por TNF en células L929

A.

.. TB-A

• TBwt

• InfIildm.b

o 0, 01 0, ' '0 .eo , (100 'coco (AH] en na/mi

I ITBwI IntflllimobTB-AI .a., .

CI" [ng/mi) 10, 31 '2, 51

B.

c.

GPO' 0, 0' 0, 1 1:0 1ao 1000

fJ\IIl--.

ITlI-AFab

29.1 65, 9

Cambio medio del diámetro Tl de la rodilla (cm) !O

c:

C3

.p

... O)

PBS

TNF PBS+18Otag de Ac. scFv anli-TNF TNf+ 180, , ; de Ac. scFv anti-TNF P8S+450JlII de Ac. Fab anli-TNF

'D TNF+450pOde Ac. Fab anti-TNF THF+18Op.ode Ac. Fab anli-TNF PBS+450"g de Infliximab La. TNf+~O de Infliximab La. THF.11O"g de Infliximab La. TNF+dOp.g de Infliximab Lp. TNF+11Op.g de Infliximab Lp.

Figura 7

"

. , •

~ .. I/l ..

} ~ ....

'T1

(Q

c:

Puntuación histológica ~

~

o:>

PBS+ 180¡.Lgde k .scFv artiTKf+ 180I'Dde k .scFv arti-PBS+450JlGde kFab arti-TN' '!) TNF+450llgde kFab arti-TIIF

-

TNF+1110¡&gde kFab ......TIIF. P8S+ 450, , ~de hfliximab i TNF+ 4S0I'~de hfliximab· TNF+ 1SO¡aGde hfliximab TNF+ 4SOtLg de hfliximab i P TNF+180llllde hfliximabip ..

., .,

c::::

Cambio medio del diámetro ..., de la rodilla (cm) Oi) <O

P8S

TNF

TNF +18~gdeAc sch .... reDc:iooBlo TNF. 1511" de Ac..scfvlllti-DF

TNF. 451&11 de AcscFv lllti-DF

...,

\O TNF+ 11fl1 deAc..scfvlllti-DF TNF. 1St", de AcFab !Di-DF TNf+ CSI&II de AcFab lllti-lN'" TMF. 11, , 9 deAcFab lllti-lN'" TNF+ 1511'1de hllxinatJ i.a. TNF.45pl de ., fIlcinab i.a.

TNF+ 111'11 de ~i.a. TNF+ 156J&S1 de ~i.p. TNF+ 451" de hllxinatJi.p. TNF+111'1 de hlixiflabi.p.

'T1

Puntuación histológica (C

c:

..,

Q)

..... TNF

TNF + 1IOflQdesd'v 110 ....aciona... TNF+ 156, .g de Ac.scFv Iri-DF . TNF+ 45jlQ de Ac.scFv arti-TNF . TNF+ 11119 de Ac.scFv Iri-DF •

'D

TNF+ 156"ude Ac.Fab arü-DF TNF+ 45, &9 de Ac.Fab arü-DF TNF+ 1', .8 de Ac.Fab arü-DF TNF+ 156119 de hfixmBb iJil. TNF+ 4"Jl9 de hfixmBb iJil. TNF+ 11J19 de hfixmBb iJil.

TNF+ 156p9 de lnfIxinab i.p. TNF+ 45, , 9 de lnfIxinab i.p. TNF+ 11, , 9 de lnfIxinab i.p.

w

Figura 11

Estabilidad de T8-A, 3 días a 3rC

1, 2

.. suero y fluido vítreo

1, 0

• TBSTM

....

<4$0m\

• orina .".

• fluido de la cámara ., .

', 2

', 0

0, 001

fluido del fluido de la

su ero cuerpo vítreo T B S T M ori n a cámara anterior

Ko 3, 622 3, 184 3, 394 4, 141 2, 970