Ácidos nucleicos y proteínas NOD2.

Un ácido nucleico aislado y purificado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo queconsiste en las SEC ID Nº 1 y 33 y las secuencias que tienen una identidad de al menos 80 % con las SEC ID Nº 1 y33.

Ácidos nucleicos y proteínas NOD2

Campo de la invención La presente invención se refiere a moléculas de señalización intracelular, en concreto a la proteína y los ácidos nucleicos Nod2 que codifican la proteína Nod2. La presente invención proporciona ensayos para la detección de Nod2 y polimorfismos de Nod2 asociados con estados de enfermedad. La presente invención proporciona además inhibidores de la señalización de Nod2 y procedimientos para identificar los componentes de la vía de Nod2.

Antecedentes de la invención Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) se definen por una inflamación intestinal crónica y recidivante de origen oculto. La EII se refiere a dos trastornos distintos, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa (CU) . En ambas enfermedades parece que participa una respuesta inmunitaria mal regulada a los antígenos del tracto GI, una brecha en la barrera mucosa y/o una reacción inflamatoria adversa a una infección intestinal persistente. Los contenidos luminales del tracto GI y las bacterias estimulan de forma constante el sistema inmunitario de la mucosa y un delicado equilibrio de las células y moléculas proinflamatorias y antiinflamatorias mantiene la integridad del tracto GI sin provocar una inflamación grave y dañina. Se desconoce cómo comienza la cascada inflamatoria de la EII, pero la estimulación constante dependiente de antígenos GI de los sistemas inmunitarios de la mucosa y sistémicos perpetúa la cascada inflamatoria y dirige la formación de lesiones.

No existe una cura conocida para la EII, que afecta a 2 millones de americanos. Se ha estimado que los costes de los procedimientos actuales del tratamiento de los síntomas de EII son de 1, 2 billones de $ anuales solo en EE.UU.

En pacientes con EII, las úlceras y la inflamación del revestimiento interno del intestino conducen a síntomas de dolor abdominal, diarrea y sangrado rectal. La colitis ulcerosa se produce en el intestino grueso, mientras que la enfermedad de Crohn puede afectar a todo el tracto GI así como a los intestinos delgado y grueso. Para la mayoría de los pacientes la EII es una afección crónica con síntomas que duran de meses a años. Es más habitual en adultos jóvenes, pero se puede producir a cualquier edad. Se encuentra en todo el mundo, pero es más frecuente en los países industrializados como EE.UU., Inglaterra y el norte de Europa. Es especialmente frecuente en personas de ascendencia judía y también existen diferencias por razas en cuanto a la incidencia. Los síntomas clínicos de la EII son sangrado rectal intermitente, dolor abdominal de tipo calambres, pérdida de peso y diarrea. El diagnóstico de la EII se basa en los síntomas clínicos, el uso de un enema de bario, pero la prueba más precisa es la visualización directa (sigmoidoscopía o colonoscopia) . La protracción de EII es un factor de riesgo del cáncer de colon. El riesgo de cáncer comienza a elevarse significativamente tras de ocho a diez años de EII.

Algunos pacientes con CU solo sufren la enfermedad en el recto (proctitis) . Otros con CU tienen la enfermedad limitada al recto y al colon adyacente izquierdo (proctosigmoiditis) . Aunque otros tiene CU en todo el colon (EII universal) . En general, los síntomas de CU son más graves cuanto más extensa es la enfermedad (una mayor parte del colon está afectada por la enfermedad) .

El pronóstico de los pacientes con la enfermedad limitada al recto (proctitis) o con CU limitada al final del colon izquierdo (proctosigmoiditis) es mejor que cuando la CU afecta a todo el colon. Puede ser suficiente con tratamientos periódicos breves con medicamentos orales o enemas. En aquéllos con la enfermedad más extensa, la pérdida de sangre de los intestinos inflamados puede producir anemia y puede requerir tratamiento con suplementos de hierro o incluso con transfusiones de sangre. Rara vez el colon se dilata de forma aguda a un tamaño grande cuando la transformación pasa a ser muy intensa. Esta afección se llama megacolon tóxico. Los pacientes con megacolon tóxico están extremadamente enfermos con fiebre, dolor y distensión abdominal, deshidratación y malnutrición. A menos que el paciente mejore rápidamente con la medicación, habitualmente se necesita cirugía para evitar la rotura del colon.

La enfermedad de Crohn se puede producir en todas las regiones del tracto gastrointestinal. Con esta enfermedad se produce obstrucción intestinal por inflamación y fibrosis en un gran número de pacientes. Los granulomas y la formación de fístulas son complicaciones frecuentes de la enfermedad de Crohn. Las consecuencias de la progresión de la enfermedad incluyen alimentación intravenosa, cirugía y colostomía.

Los medicamentos más usados para tratar la EII son fármacos antiinflamatorios como los salicilatos. Las preparaciones con salicilato han sido eficaces en el tratamiento de la enfermedad leve a moderada. También pueden disminuir la frecuencia de los brotes de la enfermedad cuando los medicamentos se toman de forma prolongada. Ejemplos de salicilatos incluyen sulfasalazina, olsalazina y mesalamina. Todos estos medicamentos se administran por vía oral a dosis elevadas para obtener un beneficio terapéutico máximo. Estos medicamentos no carecen de efectos secundarios. La azulfidina puede producir malestar de estómago cuando se toma a dosis elevadas y, en casos raros de inflamación renal leve, se han notificado con algunas preparaciones de salicilatos.

Los corticosteroides son más potentes y de acción más rápida que los salicilatos en el tratamiento de la EII, pero los efectos secundarios potencialmente graves limitan el uso de corticosteroides a los pacientes con enfermedad más grave. Los efectos secundarios de los corticosteroides suelen producirse con el uso prolongado. Incluyen adelgazamiento del hueso y la piel, infecciones, diabetes, emaciación muscular, redondeado de la cara, alteraciones psiquiátricas y, rara vez, destrucción de las articulaciones de las caderas.

En los pacientes de EII que no responden a los salicilatos o a los corticosteroides se usan medicamentos que suprimen el sistema inmunitario. Ejemplos de inmunosupresores incluyen azatioprina y 6-mercaptopurina. Los inmunosupresores usados en esta situación ayudan a controlar la EII y permiten la reducción gradual o la eliminación de los corticosteroides. No obstante, los inmunosupresores aumentan el riesgo de infección, insuficiencia renal y la necesidad de hospitalización.

Claramente existe una gran necesidad de identificar la base molecular de la EII o de sus trastornos asociados, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a moléculas de señalización intracelular, en concreto a la proteína y los ácidos nucleicos Nod2 que codifican la proteína Nod2. La presente invención proporciona ensayos para la detección de Nod2 y polimorfismos de Nod2 asociados con estados de enfermedad. La presente invención proporciona además inhibidores de la señalización de Nod2 y procedimientos para identificar los componentes de la vía de Nod2.

Por tanto, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado y purificado que comprende una secuencia que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3 y

34. En algunas formas de realización, la secuencia de ácidos nucleicos está unida operablemente a un promotor heterólogo. En algunas formas de realización, la secuencia de ácido nucleico está contenida dentro de un vector. En algunas formas de realización, el vector está dentro de una célula huésped.

En otras formas de realización, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico aislado y purificado que hibrida en condiciones de rigurosidad baja con un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en la SEC ID Nº 1 y 33. En algunas formas de realización, la secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que activa NF-KB. En otras formas de realización, la presente invención proporciona un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico. En otras formas de realización más, el vector está dentro de una célula huésped. En algunas formas de realización, la célula huésped está localizada en un organismo seleccionado del grupo que consiste en una planta y un animal.

En otras formas de realización más, la presente invención proporciona una proteína codificad por un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº 1 y 33, y variantes de la misma que tienen una identidad de al menos el 80 % con las SEC ID Nº 1 y 33, en la que la proteína tiene al menos una actividad de Nod2. En algunas formas de realización, la actividad es activación... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico aislado y purificado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº 1 y 33 y las secuencias que tienen una identidad de al menos 80 % con las SEC ID Nº 1 y

33.

2. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia está unida operablemente a un promotor heterólogo.

3. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia está contenida dentro de un vector.

4. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 3, en la que dicho vector está dentro de una célula huésped.

5. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia codifica una proteína que activa NF-KB.

6. Un vector que comprende la secuencia del ácido nucleico de la reivindicación 1.

7. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 6.

8. La célula huésped de la reivindicación 7, en la que dicha célula huésped se localiza en un organismo seleccionado del grupo que consiste en una planta y un animal.

9. Una proteína seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº 2 , 3 y 34 y las secuencias que tienen una identidad de al menos 90% con las SEC ID Nº 2, 3 y 34, en la que dicha proteína tiene al menos una actividad de Nod2.

10. La proteína de la reivindicación 9, en la que dicha actividad es activación de NF-KB.

11. La proteína de la reivindicación 9, en la que dicha actividad es unión a RICK.

12. Un procedimiento ex vivo para la detección de un polinucleótido que codifica la proteína Nod2 en una muestra biológica que se sospecha que contiene dicho polinucleótido que codifica la proteína Nod2, que comprende la etapa de hibridar la secuencia polinucleotídica de la reivindicación 1 al ácido nucleico de dicha muestra biológica en condiciones de rigurosidad baja, en el que dichas condiciones de rigurosidad baja comprenden condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42 ºC en una solución que consiste en 5X SSPE, 0, 1% de SDS, 5X de reactivo de Denhardt, 5 g de BSA y 100 μg/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón seguido de lavado en una solución que comprende 5X SSPE, 0, 1% de SDS a 42°C cuando se usa una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud para producir un complejo de hibridación.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, que además comprende la etapa de detectar dicho complejo de hibridación, en el que la presencia del complejo de hibridación indica la presencia de un polinucleótido que codifica Nod2 en dicha muestra biológica.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que antes de dicha hibridación se amplifica dicho ácido nucleico de dicha muestra biológica.

15. La proteína de la reivindicación 9, en la que dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº 2, 3 y 34.

16. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº 1 y 33.

17. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho polinucleótido que codifica Nod2 tiene la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID Nº 33.

Secuencia del ADNc de Nod2

Secuencia de ADNc de Nod2

Secuencia AA de Nod2, mutante Exón 11 de Nod2, mutante