Zymomonas con producción aumentada de etanol en medio que contiene azúcares concentrados y acetato.

Un microorganismo recombinante del género Zymomonas capaz de utilizar xilosa para producir etanol porfermentación en un medio de azúcares mixtos,

comprendiendo dicho microorganismo al menos una modificacióngenética en el gen himA, que reduce la expresión de la proteína de la subunidad alfa del factor endógeno deintegración del hospedador (HimA) codificada por un gen himA.

Zymomonas con producción aumentada de etanol en medio que contiene azúcares concentrados y acetato REMISIÓN A UNA SOLICITUD AFÍN Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional U.S. No. 60/983750 presentada el 30 de octubre de 2007. DECLARACIÓN DE DERECHOS DEL GOBIERNO Esta invención se realizó con ayuda del Gobierno de los Estados Unidos bajo el Contrato No. 04-03-CA-70224 otorgado por el Departamento de Energía y el Contrato No. DE-AC36-08GO28308 entre el Departamento de Energía de los Estados Unidos y la Alianza para la Energía Sostenible, LLC, el Director y Operador del Laboratorio Nacional de Energías Renovables. El Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención. CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a los campos de la microbiología y la ingeniería genética. Más específicamente, se encontró que el gen himA, codificante de la subunidad alfa del factor de integración del hospedador (IHF) , está implicado en la tolerancia de Zymomonas al acetato. Se desarrolló una cepa de Zymomonas que utiliza xilosa con una modificación genética del gen himA, que exhibe producción aumentada de etanol en presencia de acetato. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La producción de etanol por microorganismos proporciona una fuente de energía alternativa a los combustibles fósiles y es por consiguiente un área importante de investigación actual. Zymomonas mobilis es un etanológeno bacteriano que crece en glucosa, fructosa, y sacarosa, metabolizando estos azúcares a CO2 y etanol por el camino de Entner-Douderoff. Es deseable utilizar biomasa lignocelulósica hidrolizada que puede proporcionar un sustrato de carbono disponible en cantidades abundantes y de coste bajo, para uso en fermentación para la producción de etanol. La xilosa es la pentosa principal en los materiales lignocelulósicos hidrolizados. Aunque las cepas de tipo salvaje de Z. mobilis no pueden utilizar xilosa como fuente de carbono, se han producido por ingeniería genética cepas recombinantes que son capaces de crecer sobre este azúcar (US 5.514.583, US 5.712.133, WO 95/28476, Feldmann et al. (1982) Appl Microbiol Biotechnol 38:354-361, Zhang et al. (1995) Science 367:240-243) . Estas cepas están modificadas para expresión de cuatro enzimas necesarias para el metabolismos de la xilosa: 1) xilosa-isomerasa, que cataliza la conversión de xilosa en xilulosa; 2) xiluloquinasa, que fosforila la xilulosa para formar xilulosa 5-fosfato; 3) transcetolasa; y 4) transaldolasa (US 5.514.583, US 6.566.107; Zhang et al. (1985) Science 267:240-243) . Equipadas con estas cuatro enzimas y la maquinaria metabólica normal de la célula, tres moléculas de xilosa se convierten en dos moléculas de glucosa 6-fosfato y una molécula de gliceraldehído 3-fosfato, que se convierten subsiguientemente en etanol y CO2 en el lado de glucosa del camino (Figura 1) . Aunque se ha logrado éxito en la producción por ingeniería genética de cepas de Z. mobilis para el metabolismo de la xilosa, las cepas no crecen y producen etanol en xilosa tan bien como en glucosa. Incluso en circunstancias ideales, el metabolismo de la xilosa es tres o cuatro veces más lento que el metabolismo de la glucosa (Lawford et al. (2000) Applied Biochemistr y and Biotechnology 84-86:277-293) , y la diferencia se hace mucho mayor en condiciones adversas. Debido al lento flujo del carbono, el nivel de ATP en estado estacionario es también menor con crecimiento en xilosa (Kim et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66 (1) :186-193) , y como resultado, Z. mobilis es mucho más susceptible al estrés y los inhibidores cuando se cultiva sobre este azúcar (Joachimsthal et al. (2000) Applied Biochemistr y and Biotechnology 84-86:343-356; Kim et al. (2000) Applied Biochemistr y and Biotechnology 84-6:357-370) . Un estrés particular encontrado en la utilización de biomasa lignocelulósica hidrolizada para fermentación es la presencia de acetato (Kim et al. (2000) Applied Biochemistr y and Biotechnology 84-86:357-370, que se libera de los residuos xilosa acetilados en hemicelulosa durante los procesos de pre-tratamiento y sacarificación. Los mecanismos para que Z. mobilis haga frente al estrés relacionado con el acetato y otros ácidos orgánicos no están dilucidados, y no existe informe alguno en la bibliografía acerca de los genes que pueden jugar un papel en este proceso. Por consiguiente, la utilización de diseño racional para producir por ingeniería genética una cepa que tenga resistencia incrementada al acetato no es una opción en la actualidad. Por otra parte, se han descrito mutantes de Z. mobilis que tienen mayor tolerancia al acetato (Joachimsthal et al. (1998) Biotechnol. Lett. 20 (2) :137142; Jeon et al. (2002) Biotechnol. Lett. 24:819-824; Solicitud de Patente US 20030162271) . Se utilizó la selección después de mutagénesis química aleatoria con nitrosoguanidina (NTG) para generar estos mutantes, pero los genes modificados que eran responsables del fenotipo resistente al acetato no fueron identificados en ninguno de estos casos. Tampoco se determinó si eran necesarias una sola mutación o múltiples mutaciones para mejor eficiencia de fermentación en presencia de acetato. Por consiguiente, no se conoce actualmente por los estudios arriba citados el modo de impartir tolerancia al acetato a otras cepas de Z. mobilis utilizando ingeniería genética dirigida.

3 Persiste la necesidad de identificar genes implicados en la tolerancia al acetato que puedan modificarse para producir cepas de Zymomonas tolerantes al acetato para fermentación de hidrolizado, producido a partir de biomasa lignocelulósica pretratada y sacarificada, a fin de producir etanol. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a cepas de Zymomonas que utilizan xilosa que tienen una eficiencia mejorada en presencia de acetato. Los Solicitantes han descubierto que la tolerancia al acetato se ve afectada por el gen himA que codifica la subunidad alfa del factor de integración del hospedador (IHF) . Una Zymomonas que utiliza xilosa con una modificación genética adicional del gen himA tiene tolerancia incrementada al acetato cuando se cultiva en mixturas concentradas de glucosa y xilosa en presencia de acetato. La modificación de himA proporciona una expresión reducida del gen himA endógeno. En estas condiciones, la utilización de xilosa y la producción de etanol son significativamente mayores para la cepa himA modificada que para una cepa comparable que exprese el gen himA normal. De acuerdo con ello, la invención proporciona un microorganismo recombinante del género Zymomonas que es capaz de utilizar xilosa para producir etanol por fermentación en un medio de azúcares mixtos, comprendiendo dicho microorganismo al menos una modificación genética que reduce la expresión del gen himA endógeno que codifica la proteína de la subunidad alfa del factor de integración del hospedador. Adicionalmente, la presente invención proporciona un proceso para generar el microorganismo arriba descrito, comprendiendo dicho proceso: a) proporcionar una cepa de Zymomonas recombinante capaz de utilizar xilosa para producir etanol en condiciones adecuadas en las que el genoma de dicha cepa expresa la proteína de la subunidad alfa del hospedador de integración endógeno (HimA) ; y b) modificar el genoma de dicha cepa en donde dicha modificación reduce la expresión de la proteína de la subunidad alfa del factor endógeno de integración del hospedador (HimA) . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Y DESCRIPCIONES DE LAS SECUENCIAS La invención puede comprenderse más plenamente a partir de la descripción detallada que sigue, las Figuras, y las descripciones de secuencias que se acompañan que forman parte de esta solicitud. La Figura 1 muestra un diagrama de las cuatro enzimas (en recuadros) que se han utilizado para producir por ingeniería genética Z. mobilis para utilización de xilosa y los caminos bioquímicos para producción de etanol utilizando xilosa. La Figura 2 muestra un mapa plasmídico de pMODgap/aada, el plásmido que se utilizó para degenerar una biblioteca de inserción de transposón en ZW801-4. La Figura 3 muestra un gráfico del crecimiento de ZW801-4 en una mixtura concentrada de glucosa y xilosa con dos cantidades de acetato diferentes. La Figura 4 muestra gráficos de utilización de glucosa, utilización de xilosa, y producción de etanol para el cultivo de la biblioteca de mutantes de inserción de transposón enriquecida en comparación con la cepa de control, ZW801-4, en medio con 100 g/l glucosa, 90 g/l xilosa y 6 g/l acetato (A) , o con 105 g/l glucosa, 100 g/l xilosa y 9 g/l acetato (B) . La Figura 5 muestra gráficos de crecimiento en medio que contiene glucosa para ZW801-4 (A) y el mutante de inserción de transposón, AcR#3 (B) con cantidades diferentes... [Seguir leyendo]

34 1. Un microorganismo recombinante del género Zymomonas capaz de utilizar xilosa para producir etanol por fermentación en un medio de azúcares mixtos, comprendiendo dicho microorganismo al menos una modificación genética en el gen himA, que reduce la expresión de la proteína de la subunidad alfa del factor endógeno de integración del hospedador (HimA) codificada por un gen himA. 2. El microorganismo recombinante de la reivindicación 1, en el cual la modificación genética es una modificación del gen himA seleccionada del grupo constituido por inserción, deleción, mutación, cosupresión, y expresión de RNA antisentido. 3. El microorganismo recombinante de la reivindicación 2, en el cual el gen himA se ha hecho no funcional. 4. El microorganismo recombinante de la reivindicación 3, en el cual se introduce una inserción en el gen himA por recombinación homóloga. 5. El microorganismo de la reivindicación 1, que comprende genes heterólogos que codifican xilosaisomerasa, xiluloquinasa, transaldolasa y transcetolasa. 6. Un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual los genes heterólogos que codifican xilosa-isomerasa, xiluloquinasa, transaldolasa y transcetolasa son de bacterias seleccionadas del grupo constituido por Xanthomonas, Klebsiella, Escherichia, Rhodobacter, Flavobacterium, Acetobacter, Gluconobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Salmonella y Pseudomonads. 7. Un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual los genes heterólogos son de E. coli. 8. El microorganismo de la reivindicación 1, en el cual el microorganismo tiene eficiencia de fermentación mejorada en presencia de acetato en comparación con un microorganismo sin modificación genética alguna que reduce la expresión de la proteína de la subunidad alfa del factor endógeno de integración del hospedador (HimA) . 9. El microorganismo de la reivindicación 8, en el cual el microorganismo produce al menos aproximadamente 4% más etanol en presencia de acetato que una cepa isogénica sin expresión reducida de la proteína de la subunidad alfa del factor endógeno de integración del hospedador (HimA) . 10. Un proceso para generar el microorganismo de la reivindicación 1 que comprende: a) proporcionar una cepa recombinante de Zymomonas capaz de utilizar xilosa para producir etanol en condiciones adecuadas en las cuales el genoma de dicha cepa expresa la proteína de la subunidad alfa del factor endógeno de integración del hospedador (HimA) ; y b) modificar el genoma de dicha cepa en la cual dicha modificación reduce la expresión de la proteína de la subunidad alfa del factor endógeno de integración del hospedador (HimA) . 11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual la cepa recombinante de Zymomonas de (a) es ZW658, depositada bajo el número de acceso ATCC PTA 7858. 12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual la modificación genética es una modificación del gen himA seleccionada del grupo constituido por inserción, deleción, mutación, cosupresión, y expresión de RNA antisentido.  

35 Camino Entner-DoudoroffD-GlucosaGlucosa-6-PGluconolactona-6-P6-P-Gluconato2-Ceto-3-desoxi-6-P-GluconatoGliceraldehído-3-P1, 3-P-Glicerato3-P-Glicerato2-P-Glicerato PiruvatoFosfoenolpiruvato AcetaldehídoEtanol Camino del Metabolismo de la XilosaD-Xilosa Xilosa-isomerasaD-XilulosaXiluloquinasa Ribosa-5-P Ribulosa-5-PD-Xilulosa-5-P Transcetolasa Gliceraldehído-3-PSedoheptulosa-7-P TransaldolasaTransaldolasa Fructosa-6-PFructosa-6-PGliceraldehído-3-P Transcetolasa Eritrosa-4-P  

36 3830 pb  

37 DO600 Tiempo (horas) Sin acetato 5 g/l acetato 6g/l acetato  

38 Tiempo (horas) Glucosa Xilosa Etanol Séptimo Paso Glucosa Séptimo Paso Xilosa Séptimo Paso Etanol  

39 Tiempo (horas) Glucosa Xilosa Etanol Séptimo Paso Glucosa Séptimo Paso Xilosa Séptimo Paso Etanol  

40 DO600 Acetato Tiempo (horas) DO600 Acetato Tiempo (horas)  

41 DO600 Sin acetato DO600 Sin acetato  

42 Tiempo (horas) Glucosa Xilosa Etanol Glucosa Xilosa Etanol  

43 Xilosa Glucosa Tiempo (horas) Xilosa Glucosa Tiempo (horas)  

44 A Fig. 9C promotor adhI 6429 pb LDH (extremo 5') promotor ldh promotor adhILDH (extremo 3') 6371pb promotor ldhLDH (extremo 5') LDH (extremo 3')  

45 promotor adhI 6063 pb De Fig. 9B promotor ldh LDH (extremo 5') LDH (extremo 3')  

46 DNA cromosómico de ZW658 Cebador CCebador A Cebador DCebador B DNA flanqueante de 5' himADNA flanqueante de 3' himA DNA flanqueante de 5' himA DNA flanqueante de 3' himA 6074 pb  

47 Tiempo (horas) Glucosa Xilosa Etanol Glucosa Xilosa Etanol Tiempo (horas)  

48 DO600 Acetato Tiempo (horas) Acetato DO600 Tiempo (horas) DO600 Tiempo (horas) Acetato